摘 要 / Abstract
激素类药物在临床上可用于治疗系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病，还可抑制皮肤炎症，但激素长期暴露于人体皮肤会引起一系列不良反应，对人体健康造成伤害。《化妆品安全技术规范（2015 年版）》已经发布了化妆品中63 种激素成分的检测方法，但实际执法中发现有商家对已有激素结构基础进行修饰，合成新的激素类化合物以逃避监管。基于此，本文综述了化妆品中非法添加激素类化合物的靶向和非靶向检测手段，旨在为化妆品质量安全监测和非法添加物的监管提供技术支持和参考依据。
Hormones, employed clinically for treating, systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases, demonstrate anti-inflammatory effects when applied to the skin. However, long-term exposure of hormones to human skin can lead to adverse reactions posing health risks. The Safety and Technical Standards for Cosmetics (2015 edition) has released a method for detecting 63 hormonal components in cosmetics. Nevertheless, there is evidence of businesses modifying existing hormone structures to synthesize new compounds, evading regulatory oversight. This paper reviews targeted and nontargeted detection methods for illegally added hormonal components in cosmetics, aiming to provide technical support and references for the monitoring of cosmetic quality, safety and the regulation of illegal additives.
关 键 词 / Key words
激素；靶向；非靶向；化妆品；质量；安全；监管
hormones; targeted analysis; non-targeted analysis; cosmetics; quality; safety; regulation
1、引 言
随着我国经济发展，人民生活水平不断提高，消费者对化妆品的需求以及消费理念均得到提升，我国化妆品市场规模也随之迅速扩大。当前市场上的化妆品种类层出不穷，成分多样，其主要用途是在不改变人体结构、功能的前提下清洁美化、增加魅力或者修饰容颜。化妆品作为直接作用于人体皮肤的日用化学工业产品，其安全性保障尤为重要。化妆品中非法添加物的检测是我国保障化妆品安全的重要监管方向，其中激素类化合物更是重点监测对象。
激素是由内分泌腺或内分泌细胞分泌，在体内作为信使传递信息，是对机体生理过程起调节作用的高效生物活性物质。一些添加激素类化合物的化妆品会让消费者在使用后短时间内取得较好的除皱、增加皮肤弹性[1] 等效果，部分商家试图通过非法添加提高产品的市场竞争力并获取利润。但长期使用这类化妆品会引起皮肤甚至身体的一系列不良反应，例如长期使用糖皮质激素会引起皮肤瘙痒、红肿、代谢紊乱甚至诱发溃疡、出血、皮肤病变、骨质疏松等[1] ；长期使用性激素也会产生一系列的皮肤问题，包括血管扩张、生成黑斑、皮肤萎缩，甚至会有致癌风险[1]，严重威胁着公众的身体健康。尽管我国《化妆品安全技术规范（2015 年版）》[2]和欧盟化妆品法规Regulation (EC) No 1223/2009 [3] 都明确规定了禁止在化妆品中的添加激素类化合物，仍有部分商家无视法规，在化妆品中添加各类激素，如糖皮质激素[4-6]、雌激素[7]、孕激素[6, 8] 等。
化妆品已成为公众日常生活中不可缺少的组成部分，化妆品的质量安全更是保障公众美好生活的重要一环。本文从靶向和非靶向两种分析手段入手，综述了近年来化妆品中激素类化合物筛查和检测方法的研究进展，以期为化妆品中激素类化合物的质谱二级碎片逆向推到非靶向筛查提供数据支撑。
2、激素类化合物的靶向检测方法
化妆品中激素类化合物的靶向检测是指针对化妆品样品中的某一特定组分进行监测分析，是一种有指向性的检测手段。靶向检测的主要目的是验证样品中是否存在目标激素组分， 同时对样品进行定量分析， 测定目标组分在样品中的含量。目前， 检测化妆品中激素类化合物的主要方法为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[9-14]、超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography，UPLC）[15-17]、液相色谱- 质谱联用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[18-34] 等。
2.1 高效液相色谱法
杨德辉等[9] 利用双频超声波萃取前处理技术结合HPLC 建立了化妆品中7 种性激素的快速测定方法，采取双频超声波萃取法对膏霜乳类样品进行前处理，可以减少空白基质的干扰和待测成分的损失，提高回收率。Liu 等[11] 提出了一种以氢化可的松和地塞米松为模板分析合成核壳结构均匀的双模板磁性分子印迹聚合物（MMIPs） 的新方法， 将MMIPs 与HPLC 耦合应用于提取、分离化妆品中的氢化可的松和地塞米松，可在低浓度水平实现两种激素化合物的选择性分离和富集。Guo 等[12] 采用选择性单分散分子印迹微球基质固相分散- 高效液相色谱（MMM-MSPD-HPLC）相结合的方法，建立了化妆品中地塞米松和氢化可的松的测定方法。所制备的分子印迹单分散微球对地塞米松和氢化可的松具有良好的特异性亲和力，可有效提取化妆品中的地塞米松和氢化可的松，避免基质干扰。Wei 等[13] 建立了微固相萃取结合HPLC 检测化妆品中醋酸泼尼松龙、泼尼松、泼尼松龙的方法，采用基于多孔整体聚合物的微固相萃取法提取样品，能够提高化妆品中糖皮质激素的富集效率，在实际样品分析时，极大减小了基质峰的干扰并提高了待测物的响应。Zhao 等[14] 建立了深共晶溶剂基磁性凝胶（DES-MCG）辅助磁性固相萃取（MSPE）结合高效液相色谱- 二极管阵列检测器（HPLC-DAD） 测定化妆品中4 种性激素含量的方法，其运用响应面法对提取过程的主要变化进行优化， 选择DESMCG作为吸附剂，极大提高了性激素提取效率，减少了待测物流失。
2.2 超高效液相色谱法
UPLC 的原理与HPLC 基本相同，但其使用的固定相颗粒更小，色谱柱粒径更小，样品的分离效率更高。周江等[15] 采用UPLC 同时测定化妆品中4 种糖皮质激素，通过对样品提取方法的优化，提高了分离效率，在6min 内即可完成测定。胡贝等[16]建立了液态水基类化妆品中22 种性激素的UPLC 分析方法， 样品经80% 乙腈超声提取、结合PriME HLB 固相萃取柱净化，可提高提取效率和分离度，适用于液态水基类化妆品种性激素的测定。翁少梅等[17] 建立了测定化妆品中丙酸氯倍他索、己烯雌酚、β-雌二醇、炔雌醇、黄体酮、甲炔诺酮和丙酸睾丸素的UPLC 方法，采用单因素变化与响应面优化结合的方式对固相微萃取条件进行优化，相较于传统前处理方法提高了检测灵敏度并减少了溶剂的使用，降低了分析成本。
2.3 液相色谱- 质谱联用法
液相色谱- 质谱联用法是当前最常用的化妆品中禁用组分分析方法。通常使用HPLC[18-24] 或UPLC[25-34] 与质谱仪串联进行分析。
Golubović 等[18] 采用HPLC-MS法测定化妆品中11 种皮质类固醇的含量，在实际样品中检测出两批样品分别含有泼尼松龙醋酸酯和倍他米松二丙酸酯。Giaccone 等[19] 采用反相高效液相色谱- 电喷雾- 串联质谱法（RP-HPLC-ESI-MS/MS） 对化妆品中糖皮质激素进行测定，通过对比化妆品样品和标准品的一级质谱图、二级碎片离子质谱图检测化妆品中的类固醇组分。化妆品基质复杂，传统的前处理技术有时无法避免基质效应的影响，在前处理阶段结合不同的萃取技术可以有效减少基质的干扰，提高分离效率。温家欣等[22] 利用Captiva EMR 固相萃取柱对长烃链结构化合物的吸附作用，有效去除了化妆品中脂类、蜡类以及表面活性剂等基质的干扰，建立了化妆品中42 种糖皮质激素的HPLC-MS 测定方法，并在两份样品中分别检测出氯倍他索丙酸酯和地塞米松。朱海佩等[23] 以亚铁氰化钾和醋酸锌对样品进行沉淀后经HLB 固相萃取柱，提高了净化速度并有效减少了杂质干扰。相对于一般的固相萃取技术，分散固相萃取技术（QuEChERS）是一种更简单快速的方法。使用QuEChERs 技术净化样品， 能够节省大量时间和经济成本。吴鸳鸯等[24] 利用QuEChERS 净化柱对样品进行处理，对比分析了不同组合条件下的净化剂对提取效率的影响。研究发现，单独使用N- 丙基乙二胺（PSA）净化剂能有效去除化妆品基质中的色素和有机酸等极性较强的干扰物，提高样品的提取效率，减少待测物的损失。基于此建立的HPLC-MS 检测方法在实际样品中检测出1 批次黄体酮阳性样品，为化妆品中非法添加禁用组分的监管提供了技术支撑。
蒋凤兵[25] 建立了测定化妆品中地索奈德、环索奈德、氟尼缩松和氯二氟美松的UPLC-MS 检测方法，利用该方法在市售化妆品中成功检测出1 批次阳性样品，有助于扩大化妆品禁限用组分的检测范围，为应对化妆品检测提供了技术支撑。张晓璐等[26] 建立了快速、准确检测化妆品中非法添加的7 种性激素的超高效液相色谱- 四极杆- 飞行时间质谱方法（UPLC-Q-Tof MS）。该方法能通过精确质量数分析筛查可能的化合物分子式，并对其类似物质成分进一步进行碎片离子的判定，有效排除假阳性样品，检测灵敏度和专属性良好。茹歌等[27]建立了同时测定化妆品中13 种性激素含量的UPLC-MS/MS法，其优化了水基、油基、膏霜乳液等多种化妆品基质的提取方式、提取溶剂和流动相，提高了样品的提取效率和色谱分离效率，且有效减少了基质干扰。高瑞芳等[28] 采用UPLC-MS/MS 法测定了化妆品中29 种雌性激素，其重点考察了前处理时亚铁氰化钾和醋酸锌对提取效率的影响。结果显示，加入大分子沉淀剂虽能去除化妆品中的大分子基质，但会降低部分雌激素的回收率。赵洋等[30] 采用QuEChERS 净化结合配备有多重保留机制的五氟苯基柱（PFP），实现了化妆品中同分异构体糖皮质激素倍他米松，地塞米松及其衍生物倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯的良好分离。李晶瑞等[31] 考察了3 种固相萃取柱对15 种雄激素的净化效果，发现Oasis HLB 固相萃取柱能有效去除化妆品中的黏稠基质，对15 种雄激素的回收率更高。基于此，建立了UPLC-MS/MS 法同时测定祛痘化妆品中15 种禁用雄激素的方法。乔亚森等[33] 用液液萃取法结合超声波辅助提取，实现了同时提取63 种激素，建立了准确测定面膜类化妆品中63 种激素类化合物的UPLC-MS/MS法。该方法优化了样品的前处理条件，采用乙腈为提取试剂进行超声辅助液液萃取对样品进行处理，提高了样品的提取效率。范小龙等[34] 建立了快速测定化妆品中16 种糖皮质激素类化合物的QuEChERS-UPLC-MS 检测方法，与现行国家标准及行业标准相比，该方法能实现同时分析多类药物残留，缩短了处理提取的时间，节约了检测成本。
2.4 液相色谱- 高分辨质谱联用法
徐振东等[35] 基于在线净化液相色谱- 四极杆/ 静电场轨道阱高分辨质谱（LC-Q-Obitrap HRMS） 技术分析了化妆品中41 种糖皮质激素。该方法简化了前处理过程，采用在线净化柱（Cyclone-P） 进行净化， 提高了方法的检测效率，有效避免了假阳性结果的出现。罗辉泰等[36]以QuEChERS- 同位素稀释、LC-Q-Tof MS 同时快速筛查化妆品中的86 种糖皮质激素，采用具有多重色谱保留作用的PFP，良好分离了12 组同分异构体，建立了目前种类最齐全的糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）色谱- 液相高分辨质谱筛查数据库。李杨杰等[37] 在利用高分辨质谱对甲基泼尼松龙醋酸酯的测定过程中，发现添加了一种标准外激素，其利用样品的一级MS 和二级MS/MS 质谱信息，根据二级碎片和同位素丰度信息自动解析并检索自带谱库，确证该化合物为地索奈德。
2.5 其他方法
超高效合相色谱法（UPC2）、太赫兹时域光谱技术等也常用于检测化妆品中的激素类化合物。杨光勇等[38] 建立了测定化妆品中45 种糖皮质激素含量的QuEChERS-UPC2-MS 方法，采用QuEChERS 法对样品进行前处理，极大提高了工作效率，并有效减少了基质干扰。相较传统方法，QuEChERS-UPC2-MS 法能够在更短时间内对样品进行分离，对化妆品中糖皮质激素的检测和暴露风险评估具有重要意义。庞道标等[39] 建立了测定化妆品中6 种性激素的超高效合相色谱分析方法，样品经乙腈超声处理，采用Waters Hss C18 SB 色谱柱， 对样品进行检测。通过优化提取液、助溶剂、梯度洗脱合检测波长，该方法能够在4min 内有效分离6 种激素。肖征等[40] 设计了太赫兹时域光谱快速检测系统，用于检测化妆品中禁用的皮质类固醇激素黄体酮。该方法操作简便、识别准确率高、分析时间短，为化妆品中非法添加皮质类固醇激素的检测提供了新思路。Guo 等[7] 以雌二醇分子印迹柱作为一维分离介质，与C18 反相色谱柱耦合，建立了检测化妆品中雌二醇的分子印迹整体柱二维液相色谱（MIMC-2DLC）法，所制备的雌二醇分子印迹柱对雌二醇具有较高选择性，对其他甾体激素也具有一定选择性。此外，利用该方法测定雌二醇，可有效避免内源杂质的干扰。
3、激素类化合物的非靶向筛查
化妆品的非靶向筛查旨在识别化妆品基质中的未知化合物，即利用已建立的化合物数据库对样品进行鉴别。虽然建立的化合物数据库是已知的，但筛查的化合物是未知的。非靶向筛查的一般分析策略[41-42] 主要包括数据采集、数据处理和非靶向筛查3 个步骤，如图1 所示。
对于化妆品中激素类化合物的非靶向分析，可通过特征碎片离子和质谱裂解途径，推导未知物的结构。以雌激素为例[43]，雌酮、雌二醇、马烯雌酮、17α- 双氢马烯雌酮硫酸盐和马萘雌酮硫酸盐结构类似，在质谱中均以[MH]-准分子离子为基峰，经过裂解会产生多个共同特征碎片m/z 183（m/z 181）、m/z 169、m/z 157 和m/z 143（m/z 145），如图2 所示。在对化妆品中的激素类化合物进行非靶向分析时，若检测到这些特征碎片峰，即可进一步推导其母核结构，并通过其他二级碎片的比对研判未知化合物的结构。
高分辨质谱是非靶向筛查的主要工具。目前，非靶向筛查研究主要集中于食品领域，例如刘佳等[44] 基于实验室自建质谱数据库，结合精确质量数、保留时间的对比，对猪肉中的糖皮质激素、孕激素拮抗剂、蛋白同化激素、利尿剂、抗生素等79 种药物残留进行非靶向定性筛查。Fu等[42] 开发了一种基于超高效液相色谱- 高分辨质谱（UPLC-HRMS）的非靶向筛查方法，用于寻找鱼类模型中的非法添加剂，建立了激素、抗生素、抑菌剂等添加剂的高分辨质谱数据库，利用内部数据库对比和保留时间校准等方法识别和确认风险化合物，同时其针对未知化合物碎片裂解规律，进一步分析了碎片离子。该方法可为分析属于特定种类的未知化合物提供参考依据。
非靶向筛查技术在化妆品中非法添加物的检测中应用较少，文献报道相对较少。翁东海等[45]在测定化妆品的糖皮质激素过程中，发现一种尚未被报道过的疑似糖皮质激素化合物，对其进行二级质谱碎片解析，发现其和倍他米松双丙酸酯有共同碎片m/z 485、m/z 355、m/z 336.9、m/z 318.9、m/z 301.1、m/z 291 和m/z 278.9， 其中碎片m/z 318.9和m/z 278.9 的丰度均较强，通过对未知化合物的质谱裂解途径进行推导并与倍他米松双丙酸酯的质谱裂解途径对比，推断未知化合物为倍他米松双丙酸酯的同分异构体倍他米松丁酸乙酸酯（如图3 所示），并以倍他米松丁酸乙酸酯作为标准品进行验证确认。李强等[46] 建立了快速筛查和确证化妆品中12 种糖皮质激素的超高效液相色谱- 四极杆- 静电场轨道阱质谱（UPLC-Q-Obitrap MS）分析方法。采用MS/MS 方法采集12 种糖皮质激素的二级质谱数据，建立其二级质谱数据库，并基于二级质谱数据库和建立的筛查列表对未知样品进行筛查。该方法可在10min 内分离12 种糖皮质激素，且建立的数据库可在无标物情况下对样品进行筛查。黄佳颖等[47] 基于自建禁限用组分高分辨质谱库对化妆品样品进行筛查检验，通过对样品进行未知物定性分析，发现2 批次祛斑类化妆品中出现了非法添加糖皮质激素甲基泼尼松。该方法可快速筛查定性化妆品中的非法添加未知化合物。
4、总结及展望
靶向检测是对已知物质的筛查，能定量测定不同化妆品中已知化合物的含量，是化妆品监管的主要手段；而针对化妆品中的未知风险物质，非靶向筛查能够通过对质谱碎片的分析，对比筛查数据库，推导未知化合物的母核结构，从而研判风险物质的结构，为非法添加标准方法以外的化合物预警提供技术手段。本文综述了化妆品中非法添加激素类化合物的靶向和非靶向检测研究，以期为改善目前对于化妆品中激素类化合物的监测以靶向检测为主的现状，为含有通过化学合成设计等手段将某些已知激素进行结构修饰合成的未知激素类化合物的化妆品非靶向监测研究提供思路。靶向和非靶向检测相结合分析化妆品中的激素类化合物，能为监管机构的化妆品质量监测工作提供较为全面的技术支持，为化妆品中激素类化合物的检测提供参考依据。
