受损的皮肤无法阻止有害细菌侵入组织，导致伤口感染，甚至严重的组织损伤。聚合物水凝胶可以保持良好的亲水性并具有可调节的物理和生物相容性，被认为是最有前途的伤口敷料。本期，EFL以发表在杂志《Bioactive Materials》的“Construction of multifunctional hydrogel with metal-polyphenol capsules for infected full-thickness skin wound healing”研究为例，解析如何利用甲基丙烯酸透明质酸（HAMA）与甲基丙烯酸改性丝素蛋白（SilMA）交联的抗菌复合水凝胶促进伤口血管生成并抑制炎症。
理想的伤口敷料需要提供坚固的屏障，防止外部感染，并引导皮肤细胞整合和浸润以促进伤口愈合。足够的机械强度和保湿能力、良好的生物相容性和易于细胞黏附都是伤口敷料所必需的。在这些不同的敷料中，聚合物水凝胶可以保持良好的亲水性并具有可调节的物理和生物相容性，被认为是最有前途的伤口敷料候选。在聚合物水凝胶中，透明质酸（HA）是人体内发现的一种天然聚合物，具有良好的生物相容性；丝素蛋白（Sil）是从蚕丝中分离出来的纤维部分，由于其机械性能和优异的生物相容性，已被探索用于伤口愈合；本研究利用甲基丙烯酸透明质酸（HAMA）与甲基丙烯酸改性丝素蛋白（SilMA）交联形成双网络结构的水凝胶，构建一种金属多酚胶囊（Cu-EGCG），并加载到SilMA/HAMA水凝胶伤口敷料中，以实现EGCG和铜离子的持续释放，以制备具有良好生物相容性和力学性能的复合水凝胶，更好地满足应用于伤口敷料的要求。
2. 如何制备HAMA/SilMA/Cu-EGCG 水凝胶
（1）Cu-EGCG 的合成：将EGCG、CuCl2水溶液和MOPS 缓冲液添加到样品中涡旋。通过洗涤除去过量的EGCG和CuCl2 ，得到Cu-EGCG；
（2）SilMA/HAMA 的制备：首先配制浓度为10%的SilMA水溶液，以及1%-2%（w/v）的HAMA溶液，以1:1的体积比混合在SilMA溶液中。将浓度为0.1%的LAP添加到混合溶液中作为光引发剂，用蓝光（405 nm）照射溶液 10 秒以诱导光交联。
（3）HAMA/SilMA/Cu-EGCG的合成：通过一步离子/分子组装过程，将Cu-EGCG加载到SilMA/HAMA水凝胶伤口敷料中，图1。
图1 HAMA/SilMA/Cu-EGCG的合成和应用示意图
3. HAMA/SilMA/Cu-EGCG的优势和作用
（1）HAMA/SilMA/Cu-EGCG具有良好的物理、机械和抗菌性能
SilMA/HAMA水凝胶的溶胀比随着HAMA浓度的增加而降低。所有水凝胶均在3 h时达到溶胀平衡状态，并在随后的时间内保持稳定的溶胀速率，表明水凝胶具有较好的尺寸稳定性，有利于水凝胶敷料吸收伤口渗出液。此外，水凝胶可以稳定地呈现凝胶状态，SilMA水凝胶的抗压强度为70.1 kPa，最大压缩性能为151 kPa，具有良好的交联度和机械性能。这些结果表明，SilMA/HAMA水凝胶的抗压强度可以通过改变HAMA的浓度来调节，而抗压强度的可调性意味着它可以更好地应用于各种组织和器官，使其成为一种具有良好应用前景的生物材料。降解曲线显示，SilMA/HAMA水凝胶组的降解速率比纯SilMA水凝胶组相对慢，说明这两组水凝胶的交联程度相对较高。负载Cu-EGCG水凝胶的的释放曲线显示， Cu2+的释放在96 h后趋于平缓，表明在水凝胶和金属多酚胶囊的双重作用下，Cu2+的释放有效延长。最后，SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝胶具有较好的抗菌效果，其中SilMA/HAMA/Cu-EGCG (200) 水凝胶的抗菌效果最好，琼脂平板上的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌含量最少。
图2 水凝胶的物理性能、机械性能和抗菌性能
（2）HAMA/SilMA/Cu-EGCG促进细胞增殖、迁移和血管形成
水凝胶与L929细胞共培养3天后，细胞存活率达到100%以上，表明水凝胶无毒性，有利于细胞增殖。L929细胞培养3天后，几乎所有水凝胶都发出绿色荧光，并且很少有细胞死亡。此外，SilMA/HAMA/Cu-EGCG组迁移细胞数显著高于其他组，迁移率在32小时内达到80%或更高。在血管形成实验中， SilMA/HAMA/Cu-EGCG组有明显的小管形成和分支点（图3）。说明SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝胶具有良好的生物相容性，促进细胞增殖、迁移和血管形成，具有作为水凝胶敷料的潜力。
图3 水凝胶的体外生物相容性、迁移和血管化评估
（3）HAMA/SilMA/Cu-EGCG促进伤口愈合
SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝胶组伤口愈合较好，明显高于空白对照组。第7天，五组伤口全部开始结痂，伤口收缩明显，其中水凝胶组愈合最好。上述结果表明，水凝胶中Cu2+和EGCG的协同作用可以促进感染伤口的愈合。为了进一步研究水凝胶对伤口愈合的影响，通过苏木精伊红(H&E)和Masson染色观察伤口愈合过程，SilMA/HAMA/Cu-EGCG组第7天的肉芽组织厚度较其他组要大，第14天观察到毛细血管的生长和皮肤附属器的恢复，Masson染色显示SilMA/HAMA/Cu-EGCG组创面胶原沉积面积较大，胶原纤维较致密。以上结果表明SilMA/HAMA/Cu-EGCG组的伤口显示出更快的愈合效果（图4）。
图4 水凝胶的体内感染伤口愈合研究
（4）SilMA/HAMA/Cu-EGCG在体内促进血管形成和抗炎
在SilMA/HAMA/Cu-EGCG组覆盖的伤口中观察到更多的新生血管。免疫荧光染色定量分析显示，第7天SilMA/HAMA/Cu-EGCG组CD31和α-SMA的表达水平显著高于其他组。表明，SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝胶具有良好的促进血管生成的能力，更有利于促进血管网络的三维组装和重建，可为上皮细胞的再生提供营养，加速血管生成，促进伤口愈合。在体内抗炎实验中，SilMA/HAMA/Cu-EGCG组中的iNOS（M1标记）表达下降，CD68（M2标记）表达升高，抗炎因子TGF-β1和IL-4的表达上调，促炎因子TNF-α和IFN-γ的表达下调，表明巨噬细胞可有效地从M1到M2极化，发挥抗炎作用，改变伤口炎症微环境，促进基质再生和血管重塑（图5-6）。
图5 伤口愈合的免疫荧光染色研究
图6 炎症水平的免疫荧光染色研究
4. 总结
综上所述，本研究采用光固化方法成功制备了SilMA/HAMA水凝胶，并负载金属多酚胶囊（Cu-EGCG），实现了铜离子的持续释放。该水凝胶具有良好的机械性能和生物相容性。含有Cu-EGCG的水凝胶可以显著促进L929成纤维细胞的增殖和迁移。体外和体内抗菌活性表明，含Cu-EGCG的水凝胶具有优异的抗菌活性，有效减少大鼠感染伤口中的细菌数量。动物实验结果表明，SilMA/HAMA/Cu-EGCG水凝胶可以促进大鼠感染伤口愈合，增加胶原蛋白沉积，促进血管生成，减少细菌数量，平衡炎症浸润。
文献来源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.12.009
