介绍
脓毒症（sepsis）是一种由感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，常常会导致多器官功能障碍，危及生命，是重症监护病房（ICU）死亡的罪魁祸首1。新兴的可穿戴技术为持续和同时监测人体表皮上的各种生物标志物提供变革性技术。近日，复旦大学孔继烈，方雪恩在“Nature Communications”发文：Long-term monitoring of ultratrace nucleic acids using tetrahedral nanostructure-based NgAgo on wearable microneedles2。作者报告了一种基于四面体纳米结构的格氏嗜盐碱杆菌Argonaute（NgAgo），用于在可穿戴设备上长期稳定监测体内败血症的超痕量未扩增核酸（无细胞DNA和RNA）。这款集成的无线可穿戴设备由柔性电路板、微针生物传感器和具有富集能力的可拉伸表皮贴片组成。体内实验表明，它适合于细胞游离DNA和RNA的实时监测，灵敏度为0.3 fM，最长可达14天。这些结果为体内高灵敏度的分子识别和体内核酸检测提供了一种策略。
图1详细介绍了可穿戴电子系统，该系统可在一段时间内（两周以上）内以高灵敏度连续记录未扩增的目标核酸的变化。如图1a所示，该集成的可穿戴系统由一次性微针贴片和可重复使用的电子器件（无线柔性电路板、功能性热塑性聚氨酯薄膜）组成。在本研究中，一次性微针（MN）贴片是由三电极阵列以一种紧凑的方式制成的，即三合一贴片。然后，通过喷雾印刷和铸造技术制备了由第一层银和第二层碳纳米管组成的功能性热塑性聚氨酯（TPU）。带有阳极和阴极的功能化TPU薄膜分别与无线柔性电路板（FCB）连接，它能够通过反向离子电泳富集核酸。集成的可穿戴系统的第三部分是自行设计和定制的FCB，用于电源和信号管理。
图1b显示了MN界面结构的示意图。TDN-17被用作固定在石墨烯表面上的最佳纳米支架。在本研究中，系统灵敏度的提高可能来自TDN的空间取向，如图1c所示。TDN的刚性和分子水平的介导使ISF中的超痕量生物传感成为可能，这在很大程度上涉及双电层高度的增加。在TDN-17上，作为原核Argonautes之一的NgAgo蛋白被固定以形成NgAgo/引导DNA复合物，表示为NgAgo-gDNA。在gDNA（24-bp 5′-磷酸化单链DNA）的引导下，通过Watson-Crick碱基配对搜索整个靶序列。一旦匹配，固定的NgAgo-gDNA可以与靶核酸结合，由于候选gDNA的存在，靶核酸是明确确定的稳定的。
本研究从三个方面对MN进行了改进：
（I）利用SU-8光刻胶作为疏水、刚性、非膨胀性的材料，通过光刻法制备MN，这对于构建高性能的生物传感界面具有重要意义；
（II）作为纳米支架，TDN参与生物传感界面以产生增强的信号输出;
（III）NgAgo-gDNA锚定在TDN的顶部，形成TDN-NgAgo-gDNA（表示为TDN-Ng），由于使用gDNA，这提高了测定的长期稳定性。
图1d概述了佩戴者表皮上的可穿戴电子设备，显示了其完全集成、皮肤构象和紧凑性的特性。为了获取记录的电化学数据并传输到移动终端，可穿戴电子设备使用了三种电路，包括模拟前端（AFE）、反向离子电泳和蓝牙低能（BLE），如图1e所示。AFE为MN贴片的生物传感提供了一个电路。反向离子导入模块由电池独立供电，以避免信号串扰。BLE作为一个数据采集模块，与AFE进行交互。所有这些子组件都是由一个可充电的锂离子电池供电的。
图1：| 基于TDN-Ng的核酸实时监测的集成可穿戴系统综述。a患者表皮可穿戴设备的工作流程和视图。所有数据分别传输到电子设备RE、WE和CE，分别参考参考电极、工作电极和对电极。b插图显示了微针上的工程生物传感界面，其中TDN作为锚点与石墨烯和NgAgo-gDNA结合，P指磷酸化。c生物传感机制示意图。增强的TDN-Ng界面选择性地识别目标核酸，产生不同的电势，产生电化学信号输出。d佩戴在患者手臂上的整个集成可穿戴系统的照片。比例尺，1厘米。e柔性电路板电子器件的方框图。电化学模拟前端（AFE）进行电化学传感以获取信号，蓝牙低能（BLE）模块处理信号，并通过蓝牙天线将数据传输到外部电子设备。反向离子导入模块与电池单独连接。电池被连接到电路板和USB充电端口。比例尺，1厘米。
TDN-Ng MNs的体外评价
完成可穿戴系统开发后，作者对可穿戴系统进行了体外评价。作为一种集成的可穿戴电子系统，最终需要在真实场景中实现对目标核酸的实时监测。为了便于该系统的实际应用，作者进一步研究了其灵敏度、定量检测、长期稳定性、特异性和抗干扰性能。结果显示，所制备的TDN-Ng MNs贴片在体外表现出16天的长期稳定性，可实时定量、灵敏地监测不同浓度的靶cfDNA和RNA。文章也指出，TDN-Ng MN贴片可耐受0.3 nM的非特异性核酸和80%的胎牛血清（FBS）干扰，也可在特异性识别目标EBV cfDNA。
图2：| TDN-Ng MNs对cfDNA和RNA的体外检测性能。a. TDN Ng-MN贴片在受激ISF、37°C、pH 7.4和0.01M PBS中不同浓度cfDNA的实时电流反应b.电流相应与目标浓度的校准曲线。c. 从图4b中收集的曲线斜率值d. TDN-Ng MN贴片在体外培养20天的长期稳定性 e. TDN-Ng特异性 f. TDN-Ng MN贴片在不同浓度胎牛血清下对3×10−12 M靶cfDNA的抗干扰性能。g. 研究NgAgo-gDNA复合物与3 nM RNA-168和RNA-351的结合能力。h.通过TDN-Ng MN记录的RNA-168和RNA-351的动态变化。
使用集成MNs的体内监测的性能和评价
完成体外评价后，作者进行了体内评价。在这项工作中，作者进一步验证了TDN-Ng MNs在体内用于实时监测核酸。结果显示，该TDN-Ng MN系统不仅能有效区分阳性组和NTC组，而且还能可靠地监测体内靶标cfDNA和RNA的动态变化。此外，该TDN-MN装置也可在体内表现出14天的可靠稳定性。
图3：| TDN-Ng MNs体内验证。a. 在小鼠模型实验中，实时监测的示意图和时间线，在整个实验过程中，对一只小鼠使用一个TDN-Ng MN贴片。每只小鼠均进行(I)化学发光生物成像，（II）TDN-Ng MNs，（III）PCR检测。TDN-Ng MN贴片首先在PBS（37°C，0.01M，pH 7.4）中校准100秒，以消除使用前的传感器背景变化。蓝线表示工作模式。小鼠皮肤处理步骤如下：角质层磨砂膏，75%乙醇消毒，TE缓冲液（pH 8.0）涂抹，棉花干燥。在整个过程中，小鼠被固定在一个热板上。b. 小鼠在不同时间点的2h、24 h、48 h、168 h的平行演示。c.在2h、24 h、48 h、168 h时，实时动态曲线的斜率值。d. 通过TDN-Ng MNs和金标准PCR记录的体内靶cfDNA的动态变化。 e用TDN-Ng MNs和金标准PCR和RT-PCR检测靶标cfDNA和RNA的相应图谱。f. TDN-Ng MNs在体内的长期稳定性。g. 用TDN-Ng MN贴片在36 h内连续实时监测SA脓毒症小鼠。h.用TDN-Ng MN贴片在36 h内连续实时监测PA脓毒症小鼠。
总结
综上所述，本研究提出了无线集成可穿戴电子设备，通过工程生物传感接口实时监测脓毒症相关动物模型的纵向核酸。
基于TDN和Ng系统的协同作用，可穿戴系统能够连续跟踪体内无细胞DNA和RNA靶点的动态变化，灵敏度为0.3 fM，在体内17天内具有可靠的稳定性。
作者还讨论了TDN-17随空间高度增加对TDN-Ng系统的灵敏度增强和实时监测动态平衡的机理。
目前这项工作的无扩增策略代表了基于核酸的可穿戴设备的飞跃，并加速了用于ICU医疗保健管理的下一代生物传感器的出现。
参考文献：
[1]Ma Z, Jiang Z, Li H, et al. Prevalence, early predictors, and outcomes of sepsis in neurocritical illnesses: A prospective cohort study[J]. American Journal of Infection Control, 2024.
[2]Yang B, Wang H, Kong J, et al. Long-term monitoring of ultratrace nucleic acids using tetrahedral nanostructure-based NgAgo on wearable microneedles[J]. Nature Communications,
