有关物质系药品中除主成分以外的杂质，它可能是原料药合成过程中带入的原料、中间体、试剂、分解物、副产物、聚合体、异构体，以及不同晶体、旋光异构的物质，也可能是制剂生产过程或在贮藏、运输、使用过程中产生的降解产物等。由于有关物质的含量较少，所以选择专属性强、灵敏度高、重现性好的检测方法至关重要。目前常用的方法有HPLC法和TLC法，后法已有讨论。本文主要阐述HPLC法的建立过程中供试品溶液浓度的确定。
供试品溶液浓度的确定也非常重要。虽然浓度越高越能反映被测物中杂质存在的情况，但若设定过高，会产生主峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况；若设定过低，则灵敏度不够，无法检测杂质及其含量变化。
最低检出浓度的测定可分为信噪比法和直接评价法两种。后法是目前较为科学的做法，即将仪器的灵敏度调至较适宜的值(仅对灵敏度可调节的仪器而言，目前市场上主流品牌的液相色谱仪均已设定了一个恒定、较为灵敏的值)，然后将被测物溶液不断稀释后进样测定，直至被测物峰面积无法检出为止，此时的浓度即为最低检出浓度。
最大进样量则是采用不断增加被测物溶液浓度，直至峰严重拖尾、裂峰、柱超载和检测器超载等情况出现。
根据最低检出浓度，采用“上推法”来确定供试品溶液浓度：如一般设定杂质总量小于1.0％对照液，对照溶液的浓度至少应为最低检出浓度的20～50倍，供试品溶液浓度则应是最低检出浓度的2000～5000倍。
同时还应考虑仪器、色谱柱等因素对最低检出浓度和最大进样浓度的影响(即耐用性因素)，所以供试品溶液的浓度应在保证小于最大进样量的情况下，适当设定得高些，以保证该浓度在任何试验条件下，均有足够的检测灵敏度。
表1为最低检出浓度、最大进样量、供试品溶液和对照溶液间的比例关系(进样量10μl，规定杂质限度1.0％)。
