1. 介绍
要说起实验室中最令人头痛不已的事情，检测结果超标（Out of specification，OOS）绝对可以排上前几名。一些国家的药品监管部门及国际组织也发布了关于OOS调查的指南或指导原则。对中国企业来说，主要参考原CFDA药品认证管理中心编写的《药品GMP指南——质量控制实验室与物料系统》、美国FDA颁布的药品超标结果调查指南及英国药品监督管理局颁布的超标与超常结果调查指南[1]。在GMP审计中OOS也是必查项目，同时也是容易被落缺陷的项目。在2017年及2018年国家核查中心开展的600余次跟踪检查中，涉及超标与超常结果调查的缺陷共74条[1]。而如果OOS中无效OOS的数量过多，则有可能被认为质量管理体系存在缺陷，或者实验室的检测能力会被受到质疑。因此，本文将对容易导致无效OOS发生的情况进行分析，以期对各位同仁有所帮助。本文为笔者经验之谈，如存在不当之处，还请各位同仁予以指正。
2. 无效OOS情况分析
无效OOS是指因检验过程中的过失而导致的超标情况。因此本文将按照样品检验流程以HPLC方法检测为例进行讨论，如下图：
2.1实验前准备
方法培训
检验方法于实验员而言，如同武林高手的“修炼秘籍”，如果修炼错误，轻则损伤静脉，重则走火入魔。方法需要尽可能的熟悉，尤其对特意的注意事项，例如，溶液制备过程是否需要避光，是否需要低温保存，配制后是否需要立即进样，色谱柱是否需要特殊处理，要对计算公式有深刻的理解，外标法，还是内标法，还是标准加入方法等，计算时分子量以及纯度的折算，校正因子的代入，以上都是我们平常实验时容易被忽略的地方，进而导致了OOS的发生。因此在方法培训时，尤其是首次接触方法的实验人员，主管或者有经验的实验员有义务对实验员进行充分的指导。如有可能可以采用固定的检测项目由固定人员完成[2]。
物料准备
样品应该按照规定的条件进行贮存，实验前在样品管理员处领取，领取时应注意观察样品的性状是否符合质量标准，有的样品需要避光，有的需要低温，有的需要冷冻，我们需要对这些情况进行逐一核实，样品称量或移取后，因按照规定贮存，避免变质。对照品也应进行一些的核查，尤其是有效期、纯度以及用途（定性或者定量）。
仪器准备
天平以及pH计需要进行日常校准，以保证其运行状态正常。HPLC在实验前，需要对管路，进样针和泵密封进行充分的冲洗，冲洗时应注意管路内储存是什么溶液，以及正反相的切换，冲洗时应不定时的关注仪器的压力状态，压力过高或者过低都是液相色谱仪最为常见的一种问题[3]。日常实验时应对HPLC在运行纯有机溶剂或者水与有机溶剂混合溶液时进行观察，每次压力不应存在较大差异，如差异过大则代表仪器可能存在故障。仪器冲洗完成后，根据实验选择合适的溶剂对色谱柱进行解封冲洗，例如氨基柱对水敏感，则不应使用水相比例过高的溶剂。
2.2实验进行时
流动相制备
流动相制备时应注意所使用的试剂级别是否符合实验的需求，HPLC的有机溶剂和水应当使用色谱级别，缓冲盐以及pH调节剂应至少为分析纯，因为有的流动相有机溶剂较高，同时缓冲盐的浓度加大，所以配制时，应将有机溶剂缓慢倒入置缓冲盐溶液中，如果反之，则容易出现缓冲盐析出的情况。如果保留时间对有机溶剂比较敏感，则注意使用的量筒规格，保证可以准确制备。pH调节时，应注意温度的影响。流动相在过滤时应舍弃初滤液，以避免滤膜存在干扰物质，有机溶剂应使用0.45μm的有机系滤膜，UPLC则应使用0.22μm的滤膜。如果缓冲盐与有机相混合后，过滤时间较长可能会导致有机相挥发，此时建议采用水系滤膜对缓冲盐溶液过滤后再与有机溶剂混合，然后超声进行脱气。
溶液制备
样品在称量时，应避免阳性对照品与样品之间的交叉污染，应分次称量。冷藏和冷冻的样品应放置室温后进行称量，避免温度偏低对称量造成影响。称量液体的样品时，天平不易稳定，建议采用减重法称量或者用称量舟直接称量。称量时也应结合样品的特性，如吸潮，则应尽可能快的称量，并控制天平室的湿度；如需避光，则需要在避光情况下（如开启黄光灯）进行称量[4]。称量后转移时，应对称量的器具进行充分的润洗，使样品全部转移至量瓶中。样品如果需要超声，按照方法设定超声的时间，超声结束后，溶液放置室温后再进行定容。尤其是进行固体制剂的样品制备，由于超声时间长，所以溶液温度高，导致体积膨胀，此时定容的话，结果会有非常大的偏差。溶液制备时需要选择合适的移液管，避免误差过大，如果溶液较为粘稠，应使溶液缓慢下放，避免溶液挂壁，使移取量偏低。最后进行充分匀混后，倒入HPLC小瓶中。因液相的取样针并不能完全插入HPLC小瓶底部，所以HPLC小瓶中样品溶液装入1.5ml为宜，如果进样次数较多，应注意溶液量是否充足。如果溶剂为高比例有机溶剂时，单个HPLC小瓶多次重复进样，容易出现溶剂挥发导致峰面积变大。
序列运行
在使用流动相对系统和色谱柱充分平衡后，按照方法进行序列编辑并进样测定，序列编辑后应有第二名实验员对仪器参数和序列中溶液名称以及HPLC小瓶位置进行复核，序列运行后，应对系统适用性进行着重关注，例如进样重复性，主峰理论板数，拖尾因子或分离度等。此外，因随着色谱柱使用时间的增加，柱效会逐渐下降，污染导致压力升高。如果使用含有缓冲盐的流动相，需特别注意与有机相兼容情况。色谱柱一般保存在有机相中，因此每次开始实验前必须先用高比例纯水相冲洗一段时间色谱柱，再使用缓冲盐流动相平衡；分析结束后同样先用高比例纯水相冲洗一段时间替换色谱柱中的缓冲盐，再使用有机相冲洗色谱柱[5]。
2.3实验结果报告
图谱处理
序列运行完成后，按照标准操作规范为色谱图建立合适的积分方法并对图谱进行积分，图谱应打印仪器方法，积分方法，序列表以及审计追踪便于追溯。图谱报告的设计应包含关键性的信息，例如样品名称，进样序列名称，仪器方法名称，积分方法名称，进样时间，保留时间，理论板数，拖尾因子，分离度等参数。图谱的标尺应设置合理，含量满量程即可，有关物质可根据限度水平的对照溶液进行设计，按对照溶液占量程10%-20%设计或其他合理的范围。
实验记录
实验记录应对实验过程进行及时的记录，在记录过程中也是对实验过程的复核，如果存在使用或者操作错误，也可以被以及发现。记录应当模板话，设计应简单明了，既可以保证实验的效率，又能保证完成记录的质量。计算时，应使用经验证的表格，可及时准确的判断结果。未经验证且未锁定的表格，出现计算错误的概率极大，有的计算公式非常繁琐，不易被发现问题，很容易导致结果的误判，对实验结果的复核也存在极大的挑战。所以表格的验证是件一劳永逸的事情。
结果报告
最终结果的报告，应当按照与质量标准一致，如含量结果要求在95.0-105.0%之间，则报告值应当保留一位小数。计算有关物质时，应注意报告限以下不参与总杂质的计算。
3. 总结
实验室的工作的主体脉络是清晰的，但到具体到工作细节末支上，给我们的感觉又杂又乱，所以我们要在整体上有一个清晰的认识，再对枝节上进行丰富自己的知识，这样的话，我们对实验的把控就会更加到位，更容易顺利的完成每一次实验，远离无效OOS。期待本文对您有所帮助！
参考文献：
1. 药品超标与超常结果调查处理_颜若曦
2. 降低实验室OOS的发生率_周金龙
3. 浅析检定液相色谱仪应注意的问题_韩学东
4. 药品检验机构不合格结果调查的实践与探讨_贾瑞波
5. 分析检测中液相色谱柱的选择及使用维护_刘艺
