离子色谱法（IC）是利用流动相与固定相中的离子进行可逆的离子交换，来分离离子态化学物的色谱方法。离子色谱法具有所需样品量少、专属性强、灵敏度和准确度高、自动化程度高、 操作简单等优点，适用于分析各种离子、有机酸、碱、胺类和糖类物质。自从离子色谱法被收载入2010年版《中国药典》，其在药物的分析检测领域也得到越来越广泛的应用，如阴阳离子(亚硝酸盐、卤素离子、硫酸盐、铵盐等)、抗生素、中药材的金属离子、二氧化硫残留量、有机酸的分析检测均有离子色谱的身影。这使得离子色谱法与在药物分析领域通常采用的紫外-可见分光光度法（UV-Vis）、 高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）以及质谱法（MS）等方法形成优势互补，尤其是弥补了以上几种常规方法在检测部分有机酸、阴阳离子等亲水性较强的物质方面的不足。众所周知的是，离子色谱法目前在药物分析领域仍属于小众分析技术，很多研究者甚至没有接触过此种分析技术，故本文笔者总结了一套离子色谱分析方法开发思路，共包括八大方面，旨在为广大研究者们提供参考。
一、离子的种类
确定待分析的离子种类是首要前提，这有助于选择合适的离子色谱柱和优化分离条件。如金属离子、铵根离子等阳离子、氨基酸、抗生素及有机胺类化合物适合采用阳离子型交换色谱柱；卤素离子、亚硝酸根离子、硝酸根离子、硫酸根离子、磷酸根离子等阴离子和有机酸适合采用阴离子型交换色谱柱；糖类物质可采用阴离子型交换色谱柱或专门的糖分析柱（如图片和图片），如陈熠熠等图片建立了离子色谱法分离并测定蜂蜜中糖类物质的方法，他们选取一种阴离子交换柱图片和两种糖柱：图片 和图片，这三种型号色谱柱进行对比实验。对比发现图片柱的分离度最佳；中药材及饮片中图片残留量通常采用阴离子交换色谱柱，如张烨等图片采用Dionex Ionpac AS19阴离子分析柱，采用8~40 mmol/L氢氧化钾溶液进行梯度洗脱，电导检测器检测，建立了牛黄清胃丸中二氧化硫的残留量测定方法；此外，还有一些专用的离子色谱柱，如用于图片和图片的专用色谱柱SH-AC-14，用于多聚磷酸盐的专用色谱柱SH-AC-16。
二、样品的性质和前处理方法
需要考虑样品的性质，如溶解度、电离效率、稳定性和可能存在的干扰物等，以便确定采取需要何种前处理方式，比如简单的样品稀释，还是需要特殊处理，如过滤、离心、离子交换处理、固相萃取等。一个典型的例子就是卤素类化合物中的氟、氯、溴离子的检测，由于以上元素大多以有机物形式存在, 几乎不能直接检测，考虑到卤素元素的电负性相对较高，研究者们大多采用燃烧分解将其转化成阴离子后进行测定。例如，王瑞萍等图片建立了氧瓶燃烧-离子色谱法测定塑料中氟、氯、溴三种元素含量的方法。该方法灵敏度、精密度和准确度高，适合测定不同种类塑料药包材中的卤素含量。还有研究者们采用过滤、离心等前处理方式以减小基质干扰和提高待测离子的灵敏度。陆溱伟等图片采用离子色谱法分析齐拉西酮原料药中甲磺酸根离子时用到了离心和过滤分离。龙四红等图片采用离子色谱法测定酸汤中13种有机酸时除用到离心和过滤外，还用到固相萃取。
三、色谱柱的选择
色谱柱为离子色谱分析的核心，分离各种待分析物的关键。应根据样品类型选择合适的色谱柱。常见的离子色谱柱包括离子交换柱、离子排斥柱和离子对柱等。
离子交换柱应用离子交换的原理，采用低交换容量的离子交换树脂来分离离子，主要用于有机和无机阴、阳离子的分离，有的也可用于糖类的分离，比如笔者曾在测定一种注射液中葡萄糖及果糖含量时，采用的是Waters Sugar-Pak I这种钙基阳离子柱，将葡萄糖与果糖实现良好分离，分离度在2.0左右。离子交换柱是目前应用最广泛的离子色谱柱。由于离子交换树脂耐酸碱性强，故离子交换柱可在任何pH范围内使用，另外易再生处理、使用寿命长；缺点是机械强度差、易溶易胀、易受有机物污染。
离子排斥柱的原理是以硅胶为载体，将有离子交换基的有机硅烷与其表面的硅醇基反应，形成化学键合型离子交换剂，基于Donnan排斥作用，是利用溶质和固定相之间的非离子性相互作用进行分离的。它主要用于无机含氧酸根和有机酸的分离，也可以用于醇类、醛类、氨基酸和糖类的分离。笔者在做一种注射液中葡萄糖有关物质含量测定时，采用的是Agilent Hi-Plex H色谱柱，葡萄糖和各有关物质的分离度在2.0以上，各有关物质的检测限达到0.5ppm。离子排斥柱的优点是柱效高、交换容量高、交换平衡快、机械强度高，缺点是不耐酸碱、只宜在pH 2-8范围内使用。
离子对柱的分离机理是向流动相中加入离子对试剂，这些试剂被色谱柱的固定相所保留，然后待测物质进入色谱柱后与离子对试剂进行离子交换，利用各待测物的保留不同实现分离。此机理与在液相色谱法的流动相中添加缓冲试剂类似。离子对柱主要用于表面活性阴离子和阳离子以及金属络合物的分离。离子对色谱柱可提高对待测物的选择性，改善保留，但待测物的保留易受离子对试剂浓度、流动相pH、温度、有机溶剂比例等外部因素的干扰，因此采用离子对色谱柱时建议对各个外部条件做足够的考察和筛选。
当确定了离子色谱柱类型时，还需要格外注意各个型号色谱柱的pH范围、最大耐受压力、最高耐受温度、适用的溶剂、最佳柱效流速等，以避免离子树脂失效从而导致柱效下降。
四、流动相（淋洗剂）的选择和优化
离子色谱法中流动相常被称作淋洗剂。选择合适的淋洗剂，优化淋洗剂组成和pH，可提高离子交换能力和分离效果，并改善待测物的保留。与反相液相色谱法不同，离子色谱法采用的淋洗剂常为酸、碱、盐水溶液，而较少添加有机试剂进行洗脱。根据待测离子的不同，通常的淋洗剂的选择原则如下：
4.1 分离弱保留离子的淋洗剂
常见的弱保留离子包括一价无机阴离子（如Fˉ、Clˉ、Br-）、短碳链一元羧酸（如甲酸、乙酸）和一些弱解离的组分等。分离弱保留离子常用弱淋洗离子，如图片、OHˉ、图片(洗脱能力由强到弱)。图片在电离或水解作用下容易被转化为图片，而图片的淋洗能力较强，不适用于上述弱保留离子，故图片稳定性欠佳。而图片在溶液中稳定，此类淋洗剂是分离弱保留离子的优先推荐淋洗剂。
4.2 分离高亲和力离子的淋洗剂
对离子交换树脂亲和力强的离子有两种：一种是离子电荷数大的离子，如图片、图片和多聚磷酸盐等，适用于此类离子的淋洗剂有磷酸盐水溶液；另一种是离子半径较大、疏水性强的离子，如Iˉ、SCNˉ、图片、苯甲酸和柠檬酸等。对于此类离子，推荐方法是在淋洗剂中加入有机改进剂（如甲醇、乙腈和对氰酚等）或选用亲水性色谱柱。有机改进剂的作用主要是减少样品离子与离子交换树脂之间的非离子交换作用，占据树脂的疏水性位置，减少疏水性离子在树脂上的吸附，从而缩短保留时间，减少峰拖尾，并增加检测灵敏度。
4.3 分离电荷数大的离子的淋洗剂
对于此类离子，常用方法以增加淋洗离子的浓度或选择强的淋洗离子（如图片）为主。
离子色谱对于淋洗剂的选择首要原则是淋洗离子与待测离子的亲和力接近，即一价淋洗离子洗脱一价待测离子，二价淋洗离子洗脱二价待测离子。淋洗液浓度的改变对二价和多价待测离子保留时间的影响大于一价待测离子。若多价离子的保留时间太长，增加淋洗液的浓度是较好的方法。另外，还需考虑淋洗剂的pH值带来的影响：pH值提高，体系内OH-浓度增加，一般情况下待测离子保留时间减小，但对于弱酸、多元酸，pH值提高，电离增加，保留时间反而增加，如图片、图片。
五、流速、柱温和梯度程序的优化
确定了淋洗剂后，选择合适的流速、柱温和梯度洗脱程序，以便获得良好的分离度和柱效，并提高分离效率和分析速度。与液相色谱优化方法相同，有时等度洗脱存在出峰较晚、保留时间较长、峰展宽等问题，此时可考虑提高流速、提高柱温或更改为梯度洗脱，比如龙四红等图片采用离子色谱法测定酸汤中13种有机酸时，采用的是梯度洗脱，并对流速进行过考察。结果表明，流速为1.5 ml/min（最高流速）时既可保证分离度，又可缩短分析时间。
六、检测器的选择和校准
离子色谱常用的检测器包括电导池检测器（直接电导和抑制电导）、电化学检测器（直流安培、脉冲安培和积分安培）和光学检测器（紫外-可见和荧光）等。应根据离子的类型、性质和浓度范围选择合适的检测器。电导池检测器是最常用的检测器，适用于大多数离子，尤其是抑制电导常为首选检测方式。电化学检测器通常用于能够在电极表面发生氧化还原反应的一类离子，比如硫酸根、氰根、亚硝酸根、金属离子等，也适用于糖类、糖醇和抗生素的分析。王彩媚等图片建立离子色谱法同时测定阿拉伯胶经酸水解后的单糖（鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖）和糖醛酸（D-葡萄糖醛酸），采用的是积分安培检测器，该方法灵敏度和准确度高、重复性良好。此外，电化学检测器的高灵敏度也适用于抗生素的分析，如徐艳梅等[7]建立了离子色谱法测定阿奇霉素中残留的盐酸羟胺，采用电化学检测器进行检测，盐酸羟胺的检测限和定量限分别为0.062 ng/mL和0.207 ng/mL，具有较高的灵敏度。光学检测器与离子色谱联用可提高待分析物的灵敏度，比如离子色谱与紫外检测器联用，可进一步增强待分析物的紫外吸收能力，对于自身缺少紫外吸收的离子有较好的分析适用性和检测灵敏度，目前在硝酸根和亚硝酸根离子的测定方面得到一定的应用。比如，甘露等图片建立了离子色谱-紫外检测器测定食品中亚硝酸盐和硝酸盐的分析方法, 亚硝酸盐和硝酸盐的检测限分别为0.0045 mg/L和0.0172 mg/L，该方法简便、灵敏，可用于测定食品中痕量的亚硝酸盐和硝酸盐。
无论采用何种检测器，都应定期对其进行校准和性能测试，以确保样品测试时准确可靠。
七、离子色谱与其他分析技术联用
有时候单独使用离子色谱无法满足测试需求，此时可考虑与其他分析技术联用，比如，采用离子色谱与ICP-MS或ICP 联用的方法可以对一些特定元素的价态、形态进行检测。这种检测方式可以解决元素价态、形态问题，是单独使用原子光谱或离子色谱无法实现的。王媛等图片建立了IC－ICP-MS方法用于测定人体尿液中碘元素形态及含量。该方法可对图片和I-定量测定。另外，还有研究者采用IC－ICP-MS法实现了对饮用水中三价铬和六价铬的含量测定图片。离子色谱与原子光谱的联用技术扩大了二者的应用范围。
八、方法验证和质量控制
与其他定量分析方法一样，离子色谱分析方法建立后必然需要进行方法验证，验证指标包括专属性、准确度、精密度、线性与范围、耐用性等，微量和痕量分析还需验证检测限/定量限，具体验证方法和要求可参照《中国药典》四部指导原则9101、USP<1225>和ICH Q2等指南图片。当方法验证成功后，就可用于样品的质量控制，基于分析方法全生命周期监控理念，后期的样品测试过程中仍需根据测试结果持续监控方法的稳定性和可靠性。
九、结语
本文笔者从8个方面，层层递进地阐述了一套离子色谱分析方法开发思路，意在为广大研究者在离子色谱分析方法开发方面提供参考。离子色谱法可以弥补气相色谱法(GC)和液相色谱法(HPLC)对离子型药物等进行分析时的不足，也可以解决ICP或ICP-MS无法测试元素形态、价态的问题。随着离子色谱柱种类的不断增多，色谱柱柱效越来越好，淋洗剂种类越来越多，检测器类型更佳丰富多样，未来离子色谱法在药物领域的应用范围定会越来越广，期待广大研究者们开发出越来越多的离子色谱分析方法。
参考文献
[1] 陈熠熠，赵瑜，庹苏行，等．离子色谱法同时测 定蜂蜜中的多种糖类物质[J]．广东化工，2015，42(8)：193-194.
[2]张烨，李静，丁华，等．离子色谱法测定牛黄清胃丸中二氧化硫残留量[J]．北方药学，2021，18(11)：19-22．
[3] 王瑞萍 王燕相，肖惠峰，等. 离子色谱法测定塑料中卤素含量的方法分析[J]. 合成材料老化与应用，2020，49(5)：48-50.
[4] 陆溱伟，刘静雨， 李坤鹏，等. 离子色谱分析齐拉西酮原料药中甲磺酸根离子[J]. 化学世界，2022，63(2)：100-104.
[5] 龙四红，陈谢花，李红洲，等. 离子色谱法测定酸汤中13种有机酸的分析方法[J]. 食品科技，2022，47(8)：256-263.
[6]王彩媚，宋粉云．离子色谱法同时测定阿拉伯胶水解后的单糖和糖醛酸[J]．今日药学，2018，28(11)：727-729，739．
[7] 徐艳梅，韩彬，郝丽娟，等．离子色谱–电化学法测定阿奇霉素中盐酸羟胺[J]．化学分析计量，2022，31(8)：39-43．
[8]甘露，许琳科，王佳．离子色谱－紫外检测器测定食品中亚硝酸盐和硝酸盐[J]. 盐城工学院学报(自然科学版)，2021，34(2)：74-78.
[9]王媛，刘德晔．人体尿液和血浆中碘元素形态分析方法学的研究[J]．江苏预防医学，2018，29(1)：1-3，60．
[10]陈光，林立，钱聪，等．离子色谱-电感耦合等离子体质谱联用测定饮用水中的三价铬和六价铬[J]．农业机械，2012，2：127-130．
[11] 2020年版《中国药典》四部指导原则9101.
[12] USP <1225>.
[13] ICH Q2.
