反相有关物质方法开发时，一般是基于建立一套方法对有关物质进行控制的原则，本文主要针对具有一定疏水性和极性化合物进行有关物质方法开发，故强极性化合物有关物质方法开发不在本文讨论范围内。

创新药研发周期长，涉及多个化合物（起始物料、中间体和成品等）有关物质方法开发，且创新药的工艺路线随着研发进程处于持续优化状态，因此需要不断更新杂质控制方法，有关物质方法开发任务量可见一斑，而创新药几乎很难查询到可供参考的色谱方法信息。为了在有限的时间内保质保量完成方法开发工作，起到快速助力原料药工艺路线开发与优化的目的，进一步优化人员和资源的分配，提高方法开发效率和整体质量研究水平，建立一套通用的方法开发流程至关重要。

研发初期因质量研究人员所能获知的化合物信息有限，杂质结构信息（一般工艺路线处于保密状态）未知；而在研发中后期才有可能获取该信息，故本文将有关物质方法开发流程分为这两部分分别进行阐述。

化合物水溶性较差时首选C18色谱柱，化合物水溶性较大时（如疏水性较大的氨基酸类）首选极性嵌入色谱柱，色谱柱孔径一般选择80A-130A（分子量<2000时）。

A-E类均为耐宽pH范围的C18色谱柱，其中A类为中等疏水性C18色谱柱；B类与A类不相似，疏水性存在差异(根据Eureby色谱柱性能评估参数：CDF>1或根据PQRI Database：F>3，B类疏水性略高于A类)；C类色谱柱为高密度键合C18官能团，适用于疏水异构体或类似物分离；D类固定相带正电荷，可以改善碱性化合物峰形（若要兼顾分离和峰形，也可考虑使用普通色谱柱，在流动相中加入离子对/离液剂），增加酸性化合物保留；E类为核壳柱或表面多孔柱，可提高化合物柱效和灵敏度。

F、G与H类为极性嵌入色谱柱（可兼容100%水相），在中、低pH流动相条件下这三类色谱柱对极性和疏水性化合物的选择性存在差异（疏水性顺序：G>F>H，故G类可以兼顾疏水和极性跨度较大的化合物，F和H适合疏水性不高或具有一定立体选择性的化合物，如环肽药物；立体选择顺序：F>H；F与H固定相均键合酰胺基团，具有氢键作用：H>F）；F类适用于碱性极性化合物保留和峰形改善，pH耐受范围2-11；G和H类pH耐受范围2-8；极性嵌入色谱柱可搭配含离液试剂的流动相以增强极性化合物保留，同时避免疏水化合物过度保留。

图1注释：

1. 为了提高在方法开发时色谱柱的筛选效率，建议适时归类整理耐宽pH范围的可及性色谱柱，即使筛选时暂时无法获得此类色谱柱，也可选择其他相似色谱柱(F<3或CDF<1，可通过以下两个网址进行查询：https://apps.usp.org/app/USPNF/columnsDB.html和https://www.acdlabs.com/resources/free-chemistry-software-apps/column-selector/)。

2. 首选耐宽pH范围的色谱柱，可以避免流动相pH更换时色谱柱不耐受低pH和高pH的情况，同时可有效节省更换色谱柱带来的冲柱和过渡时间，进一步提高流动相筛选效率。

3. 流动相pH选择在化合物信息未知的情况下建议从低pH依次筛选至高pH条件（通过分离度和峰形等综合评估流动相适宜的pH），同时需兼顾化合物在酸性或碱性条件下的稳定性（溶液稳定性考察可初步判断）和化合物酸碱性：在低pH下时C18色谱柱固定相的离子作用最弱，当待分析物为碱性化合物时，由离子作用造成的峰形差的可能性会大大降低；当待分析物为酸性化合物时，化合物以电中性形式存在也可提高疏水性，有助于分离；流动相选择其他pH主要基于化合物带电性能即pKa，如当以离子化形式存在的化合物间不能有效分离时，可通过改变流动相pH使离子化分析物呈电中性，提高疏水性进而改善分离。

4. 在化合物检测波长信息未知前提下，有机相首选乙腈主要基于该溶剂紫外截止波长在200nm以下，水相用于调节pH的添加剂或缓冲盐建议选择紫外截止波长较低的试剂/试药（若待分析物间的分离对流动相pH不敏感时，流动相pH是否处于缓冲盐缓冲范围内不是必需：如当流动相pH为4.5时，缓冲盐为磷酸盐也是可行的，此时磷酸盐的作用主要是为了改善峰形）；当分离存在风险时，需筛选有机相体系，如甲醇或乙腈+甲醇体系。

如何从成百上千根色谱柱中筛选出适合不同化合物分析的色谱柱，本文给出了一定参考。按照上述有关物质反相方法开发流程，可以提升研发人员的色谱柱筛选能力（特别适合新手小白），不仅提高了方法开发效率，降低成本的同时，还提升了整个团队的研发水平。