生物材料的选择是组织工程和再生医学应用发展中必不可少的一步。来源于细胞外基质(ECM)的生物材料具有允许生理上重现几个过程的特性，这些过程导致内环境平衡组织或器官功能的重建。本文综述了用于分离和加工ECM衍生生物材料的主要策略，以及用于表征其特性的不同技术。最后，对它们在术语领域的一些应用进行了探索和讨论。

 

1. 引言

 

组织工程和再生医学(TERM)是一个跨学科的领域，旨在找到修复或再生受损组织和器官的解决方案。为了实现这样的解决方案，通常需要一种ECM替代物，例如支架，并且使用来自天然或合成来源的生物材料来获得所述替代物。理想的生物材料应该结合了合成材料和自然材料的最佳特性，为了实现更高的再生/修复潜力，生物材料应该为细胞提供良好的微环境。考虑到这一点，在过去的几年里，一组特殊的生物材料引起了更大的兴趣：细胞外基质(ECM)衍生的生物材料。ECM是一个复杂的细胞产生的3D网络，它将细胞嵌入全身的组织和器官中，支持它们的功能和生存。

 

本文的目的是综述制备细胞外基质衍生生物材料的主要方法，从不同的来源(器官/组织或细胞培养)，到不同的脱细胞过程(，表征类型(生化、化学、物理、形态和生物)，最后是在该术语领域的特定应用(水凝胶、生物印刷和静电纺丝)(图1)。

 

 

2. 细胞外基质成分与细胞功能的调节

 

细胞外基质是由体内不同组织内的细胞产生的有组织的3D网络，由几个大分子组成，其最终组成因组织而异。。ECM是一个高度动态的结构，在生理和病理条件下(如癌症)，它会被多次翻译后修饰和重塑而不断改变。根据ECM的作用，这些蛋白质可以分为两类，即结构蛋白(纤维蛋白)和非结构蛋白(蛋白多糖和糖蛋白)。细胞外基质的其他基本成分包括生长因子(GFS)、整合素和各种基质金属蛋白酶(MMPs) (图2)。

 

 

2.1 胶原蛋白

 

胶原蛋白是ECM中最丰富的纤维蛋白。事实上，它是人体结缔组织(如肌腱和皮肤)中最丰富的蛋白质，大约有30个已确定的亚型。该分子参与多种机制，如旁分泌调节细胞行为，促进粘附、增殖和分化。

 

2.2 弹性蛋白

 

弹性蛋白是另一种主要的细胞外基质纤维，由原弹性蛋白亚基与一层纤维蛋白微原纤维交联而成，后者构成弹性纤维。这一特性允许富含弹性蛋白的组织具有弹性，并允许它们在受到反复拉伸时恢复/回弹。弹性蛋白作为生物材料被广泛应用于组织工程。

 

2.3 纤维连接蛋白

 

纤维连接蛋白表达在多种细胞类型的基膜上，这些细胞在脊椎动物发育过程中具有必要的功能。纤维连接蛋白和整合素之间的相互作用是最佳细胞外基质形成的基础，而细胞黏附和迁移又需要细胞外基质，影响无数的过程。纤维连接蛋白也与心血管疾病和肿瘤进展有关。

 

2.4 层粘连蛋白家族

 

层粘连蛋白家族由基底膜中的多结构域、异三聚体糖蛋白组成，与其他细胞外基质成分交联。这些三聚体亚型中的每一种都由3条链(α，β和γ)组成，根据它们的细胞和组织特异性，它们以不同的遗传形式存在。这些蛋白质与血管生成有关，有助于血管的生长和成熟。

 

2.5糖胺多聚糖

 

糖胺多聚糖(GAG)是一组由二糖重复单元组成的线性多糖。由于其显著的结构多样性，GAG具有与广泛的生物分子相互作用的能力。这些相互作用在各种生物过程中起着关键作用，包括细胞迁移、分裂、血管生成和胶原纤维形成。此外，GAG在治疗血栓、新生血管、癌症和炎症等病理疾病方面显示出治疗潜力，使其非常适合治疗应用。

 

2.6腱生蛋白

 

腱生蛋白是ECM糖蛋白的一个多功能基团，其中腱生蛋白-C是最早被描述和研究最好的。腱生蛋白家族的其他成员包括腱生蛋白-R、-W、-X和-Y。腱生蛋白具有独特的模块结构，由不同数量的重复结构域组成的相同亚基组成，其中包括七肽重复序列、一系列纤维连接蛋白III型结构域、表皮生长因子样重复序列和C-末端球状结构域。

 

2.7 其他成分包括整合素，生长因子，基质金属蛋白酶

 

3. 细胞外基质的分离和脱细胞

 

3.1来自组织/器官

 

如前所述，功能组织修复领域术语的方法之一集中在使用由生物材料制成的支架。这些生物材料可归类为合成材料或从生物来源收集的自然材料。ECM衍生的生物材料是天然来源的生物材料的一个例子。这些材料可以包括完整的细胞外基质提取物或纯化的细胞外基质成分，如I型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白或透明质酸。合成的材料可以作为模板，为功能性组织修复提供重要的信号分子。图3描述了物理和化学脱细胞过程对分离的ECM的机械和物理化学性能的影响的比较。图4展示了组织脱细胞及其形态和物理化学特征的例子。

 

3.2 来自细胞培养

 

从人或动物来源的脱细胞组织中分离出的细胞外基质是临床上最成功的生物材料之一。然而，它也存在一些限制，比如它的可用性有限。细胞培养来源的细胞外基质(CC-ECM)能够克服组织来源的细胞外基质所带来的诸多限制，并具有能够在很大程度上重现天然组织复杂生物系统的特性。因此，CC-ECM支架在长期应用中取得了显著的效。

 

4. ECM表征方法

 

如前所述，感兴趣的材料(组织/器官或细胞培养)的脱细胞过程不可避免地会对提取的细胞外基质造成变化。因此，有必要评估加工步骤对最终产品的成分和生物性能的影响。要做到这一点，通常会进行几种方法分析。通过比色分析、SDS-PAGE、Western Blot、免疫组织化学、蛋白质组学、FTIR和拉曼光谱以及圆二色谱对提取的细胞外基质的化学组成、生化组成和结构特征进行了评价。ECM的物理性能也可以通过流变学进行测定，而其热稳定性则通过差示扫描量热法进行评价。此外，可以通过扫描和透射电子显微镜以及原子力显微镜等几种显微技术对所得到的材料进行超微结构评估(形态)。最后，在体外和体内实验中对ECM衍生的构建物进行了功能生物学表征。

 

图5提供了一个流程图，以帮助研究人员使用脱细胞ECM选择最合适的表征技术，以评估不同的特征。

4.1化学、生化和结构表征

 

4.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western 免疫印迹

 

为了评估脱细胞处理后的成分，通常使用SDSPAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)比较ECM提取物中的蛋白质图谱。SDS-PAGE是一种通过在多孔凝胶中使用电流来根据蛋白质的相对分子质量分离蛋白质的技术。

 

4.1.2比色法

 

基于染料标记技术的定量方法是测定ECM组分的最常用的方法之一。可以快速、可靠、经济和灵敏地对主要元素，如胶原(总的、不溶的或可溶的)、弹性蛋白和GAG进行定量分析。比色分析以快速的程序提供了有价值的信息。从作者的观点来看，比色分析提供了对从SDS-PAGE和Western Blot获得的数据的极好补充。

 

4.1.3 组织学

 

细胞外基质组织学分析是一种定性方法来评估细胞外基质单个蛋白，并确定它们的存在和定位。要通过组织学分析组织样本，样本通常需要在树脂、OCT或石蜡中包埋，并在染色前切成薄片。图7可以看到苏木精-伊红，天狼星红等指标。

 

4.1.4傅里叶变换红外光谱和拉曼光谱

 

傅里叶变换红外光谱(FTIR)和拉曼光谱是用于化学和结构鉴定的最重要的振动光谱技术，它们相辅相成。拉曼光谱依赖于光和分子相互作用产生的非弹性光散射(拉曼效应)，从而能够识别非极性基团。

 

4.1.5 质谱法

 

质谱学是迄今为止关于ECM表征的最完整的技术。它允许鉴定和定量样品中的所有蛋白质，具有显著的重复性和灵敏度。ECM的广泛应用推动了关于这一主题的大量报告。

 

4.1.6圆二色谱

 

圆二色谱(CD)是一种光吸收光谱方法，它可以研究蛋白质的二级结构、它们与其他分子的相互作用、折叠、稳定性和配体结合性质。这种方法是基于光学活性分子对(左手和右手)圆偏振光吸收的差异来确定它们的分子构型。

 

4.2 物理表征

 

4.2.1差示扫描量热法

 

差示扫描量热法(DSC)是一种热分析方法，用于测量生物分子(如天然蛋白质)的稳定性。DSC测量与温度变化引起的转变相关的热交换，这与蛋白质的热变性或“热熔化”有关。在蛋白质的情况下，DSC可以用作配体结合的指示器，以评估热力学稳定性及其折叠机制。

 

4.2.2 流变学

 

流变学是研究材料在外加应力或力作用下的流动和变形的科学。它侧重于了解材料如何响应不同类型的机械力，以及它们的物理属性如何影响它们的流动行为。流变学评估的最重要的性质之一是粘弹性。弹性是材料在变形后恢复其原始形状的能力，而粘度是流动和耗散能量的能力。ECM同时表现出弹性和粘性特征。ECM另一个需要评估的重要流变性是硬度或刚性，它会影响细胞行为和组织功能。

 

4.3 形态表征

 

细胞外基质和细胞外基质衍生支架的超微结构也是它们在生命系统中性能的决定因素。因此，有关细胞外基质超微结构及其与周围微环境相互作用的高分辨率信息是非常重要的。因此，一些成像技术被用来研究ECM和ECM衍生支架的形态和拓扑特征，包括扫描和透射电子显微镜(SEM和TEM)和原子力显微镜(AFM)。

 

4.3.1 扫描电子显微镜

 

扫描电子显微镜(SEM)是一种强大的工具，它可以通过聚焦的电子束扫描样品的表面来创建3D图像。它提供纳米级的高分辨率图像，放大倍数可达2×105倍。可以获得有关样品的表面形貌、形态和成分的详细信息。图10显示了人类沃顿凝胶体脱细胞后细胞外基质纤维状结构的维持。

 

4.4 生物学特性

 

4.4.1 体外和体内试验

 

细胞外基质及其衍生支架的最终表征是评估其与生物系统相互作用时的功能性、生物相容性和再生潜力。为此，需要进行体外和/或体内测试。

 

5. ECM派生组件的术语应用

 

用于长期应用的ECM衍生生物材料无论是作为单独的ECM组件还是与其他生物材料集成在一起，都得到了越来越多的探索。一般来说，在设计支架时，几个关键的考虑因素是重要的：生物兼容性、生物降解性、机械性能、支架结构和制造技术。在这一部分中，我们将概述使用不同技术从ECM衍生生物材料中设计的常用支架，即水凝胶、生物打印支架和电纺支架。

 

5.1 水凝胶

 

在所研究的几种用于长期应用的ECM支架类型中，水凝胶是迄今为止研究最多的。水凝胶被定义为高度水合的3D网络，由于聚合物/蛋白质链之间的化学或物理网状结构，它保持了结构的完整性。这种高度水合的3D结构使水凝胶能够保留大量的水。水凝胶还具有其他优点，如改善的生物相容性、生物识别性和生物降解性，而不会产生毒性。

 

5.2 3D生物打印支架

 

3D生物打印是一项多用途技术，通过使用计算机设计的模型和生物墨水有效地创建具有精确和复杂结构的组织结构。这项技术使用生物墨水中生物成分的逐层精确定位，允许控制多种支架特征，如结构、成分、孔径和表面化学。众所周知，含有脱细胞ECM的生物墨水比含有其他天然聚合物的墨水具有更好的再生能力，因为它们保留了许多先前描述的组织特有的天然特征。事实上，脱细胞ECM已经被用作几种生物医学应用的生物墨水。

 

5.3 电纺技术

 

近年来，电纺技术已被用于制备具有取向多丝纳米纤维的ECM衍生支架，其结构类似于自然环境中ECM的纳米纤维骨架。这些支架提供了具有相互连接的毛孔的纳米级纤维结构，类似于天然的ECM，展示了创建功能组织的良好潜力。图11描述了这里描述的ECM的三个术语应用的例子。

 

 

6. 总结

 

本文概述了细胞外基质衍生生物材料在术语领域中的应用，从分离到应用阶段，重点介绍了表征部分。要充分实现这些材料的临床潜力，仍然存在几个挑战。

 

脱细胞技术是获得ECM衍生生物材料的关键步骤，是复杂和具有挑战性的。在保持ECM所需性能的同时，实现细胞的完全去除是深入研究的目标。验证脱细胞方案的努力的一个重要部分是选择适当的表征技术。虽然实际上有一大套可用的技术，但对ECM的完整描述是非常耗时和资源的。ECM基生物材料的一个共同特征是衍生支架的机械性能相对较弱，这在术语应用的上下文中可能被认为是有限的。

 

虽然上述所有问题都是重要的障碍，但正在进行的研究表明，这些问题将在中短期内由社区解决。对基于ECM衍生生物材料的产品进行更全面的临床前和临床测试将带来新的挑战。

 

原文信息

 

The title of the article is “Extracellular matrix-derived materials for tissue engineering and regenerative medicine: A journey from isolation to characterization and application”

 

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.01.004