前言

高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）是制药行业分析检测的主要手段，其中HPLC的运用更加广泛，常见的包括正相色谱法（NPLC）、反相色谱法（RPLC）、离子交换色谱法（IEC）、亲水作用色谱法（HILIC）等，是分析工作者首当其冲需要掌握的一门技术。

高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成图片。要做好HPLC分析方法开发，其中的关键组成部分（进样系统、分离系统、检测器）的基础知识必须掌握。

笔者此文围绕上述关键组成部分展开，旨在分享一些HPLC分析方法开发必备的基础知识点。

知识点1-检测器

检测器是观测化合物出峰的“眼睛”，“选定检测器”则是HPLC方法开发的第一起点，不同的检测器类型对应着方法可能达到的灵敏度上限、可选择的流动相范围（是否挥发性）、可选择的洗脱方式（梯度洗脱/等度洗脱）、操作是否便捷、实验的成本及方法转移的成本，一旦选定了检测器类型，就意味着方法开发的外边界确定了（比如：选定了ELSD，则流动相不可含用磷酸盐等非挥发性成分；选定了RID，则不建议采用梯度洗脱程序）。

因此，检测器的选择尤为关键，要做好分析方法开发，常见的检测器原理、适用范围、使用限制必须了解，下图可做参考图片。

读者应结合实际情况，如“是否为痕量测定、待分离组分的复杂程度、待测化合物的性质（是否有紫外吸收、是否为可激发荧光的物质）、实验室已有的设备资源、转移实验室的设备资源”综合考虑。

知识点2-进样系统

进样系统不是影响分析方法开发成败的关键点，但不合适的进样系统，必然成为分析方法开发路上的绊脚石。

进样系统的关键在于“进样溶剂、进样体积、进样温度以及洗针溶液”。

进样溶剂，即供试品的稀释溶剂，在满足样品溶解度和溶液稳定性的情况下，以初始比例流动相作为首选进样溶剂，以避免溶剂效应的产生，如需采用其他进样溶剂，应考虑溶剂的洗脱强度、溶剂的pH及其缓冲能力。

进样体积过小，影响进样精密度和灵敏度；进样体积过大，降低分离效果、甚至会因为体积过载从而导致峰平头。针对几种不同的色谱柱构造，它们的最大建议进样体积见下表图片，其他规格的色谱柱可参考下表进行调整。

进样温度指的是控温盘的温度，仅在供试品溶液需要低温条件以保持稳定的情况下才开启。方法开发过程中，采用一个已经变坏的供试品溶液（杂质谱发生变化，不具代表性）是大忌。

洗针溶液通常采用不含盐的初始比例流动相，反相色谱洗针液也常用50%甲醇-水溶液，若产生进样残留，可以结合残留物的溶解性质适当增减有机相比例或者调节洗针液的酸碱性。

知识点3-分离系统

分离系统是HPLC分析方法开发的灵魂。分离系统不是色谱柱的独舞，而是色谱柱、流动相、待测样品等共同谱写的交响乐。

待测样品通常需要掌握其组分的复杂程度（基质、待测组分的数量）用于判断样品是否需要经过特殊的前处理、是否优先考虑梯度洗脱。化合物的pKa、logP（商业化软件ACD可以给出pH-logD曲线，直观展现化合物在不同pH条件下的亲脂性）用于评估化合物的保留能力、辅助分离模式筛选、提供流动相缓冲溶液的pH选择依据。化合物的分子量用于选择匹配的色谱柱孔径，孔径大小在8~12nm的全孔和表面多孔的颗粒最常用于分子量小于10000Da 的分子，大于10000Da的分子通常采用30nm孔径的色谱柱图片。

流动相通常涉及以下几个方面：流动相pH（视情况选择具有缓冲能力的缓冲盐，以保证化合物稳定的分子-离子形态，防止保留时间飘移；特殊情况如需改善峰形和保留，可能还需要使用离子对，一旦使用离子对就需要专柱专用）；有机相种类（反相色谱中最常用的是甲醇和乙腈，乙腈的洗脱强度大于甲醇，甲醇的氢键作用更强、乙腈还可提供偶极作用）；等度或梯度洗脱（依据待测组分的复杂程度和实际分离效果选择）。

色谱柱的选择可以从以下方面考虑：色谱柱的固定相种类（分离模式是反相/正相/HILIC/手性/离子交换，选择与分离模式匹配的色谱柱，其中反相色谱柱种类繁多，重点关注基质类型、是否封端、键合官能团等）、粒径（粒径越小，柱效越高，但背压越大）、孔径（选择与化合物分子量匹配的孔径）、比表面积（比表面积越大，键合相覆盖率越高，保留能力、柱容量、柱效越高）、碳载量（碳载量越高，疏水保留能力越高）、柱温（一般情况下，柱温升高，出峰变快，峰宽越窄，分离效果更好，可设计具体实验观测柱温对实际分离效果的影响，注意实验温度不要超过色谱柱的耐受范围）。市面上的色谱柱很多，如何从成百上千的色谱柱中选出心仪的色谱柱确实是个技术活，我们也不可能一根根的去盲试，故而需要分析工作者具备一定的判断能力，除了考量上述厂家给出的色谱柱参数，反相色谱柱还可以利用一些标准化的数据库进行柱筛选，如USP网站上的柱参数（基于疏水减法模型，将色谱柱作用力归结为疏水作用、氢键作用、离子作用、形状选择作用），拥有ACD软件的企业则可以通过特有的柱筛选模块更直观、便捷的进行柱选择。其他分离模式的色谱柱，一般可以通过参考厂家给出的案例进行柱选择。当然，现在很多的色谱柱厂家有自己的技术团队，为了色谱柱更好的销售，也提供免费的分析方法开发，分析工作者也可尝试利用厂家提供的资源来解决问题。

参考文献：

【1】中国药典2020年版0512高效液相色谱法

【2】电喷雾检测器的工作特点及其在药物分析中的应用进展

【3】现代液相色谱导论