前言：

在医药领域，对于药物纯度的管控非常严格，杂质的管理贯穿于整个药物的生命周期。结晶是药物分离过程中的一个重要单元操作，结晶一开始主要是重结晶，本质上是为了控制药物产品纯度，即通过结晶工艺不仅仅可以控制产品的晶型、粒度、晶习等指标，也可以得到期望的产品纯度。本文通过梳理文献并结合经验，将不同杂质残留机理粗分为三类，对应阐述不同类别杂质的结晶除杂策略。

1、 杂质残留机理的分类

文献中，对于结晶过程中杂质残留在晶体中的机理有充分的研究。主要机理有：表面吸附、母液残留、晶体间的团聚包裹、溶液包藏、晶体缺陷嵌套、共沉淀、共晶/固体溶液。根据企业中解决实际项目的经验。从工业应用的角度，我们将机理粗分为如下三大类：排除情况、简单情况、复杂情况。

2、 排除情况

排除情况代表，实际工业项目中几乎没有因为这类API-杂质作用方式，导致药物杂质超标，从而困扰企业研发人员的。包括表面吸附杂质残留机理和母液残留机理。

图1 杂质表面吸附示意图

表面吸附：杂质小分子吸附在晶体表面，从而导致药物产品的杂质超标。实际工业应用中，不可能出现此类情况。为什么呢？从数量级上去分析： 药物晶体尺寸  10-100um，假想为立方体，表面积为0.01-0.1um2/um3，而典型的有机小分子的尺寸在10A左右，所有晶体表面都吸附满杂质小分子的话，杂质含量计算下来，最多也就接近0.001-0.01vol%。这个量是非常低的，甚至低于药企中HPLC检测下限。加之，晶体表面不是平的，不同的晶面暴露的官能团不一样  对杂质的吸附能力也不一样，不存在“杂质分子”吸附满所有晶体表面的情形，也就是说，实际情况只会比0.01vol%更少。

图2 母液残留示意图

溶液残留：母液中溶解的杂质，通过干燥溶剂挥发后，杂质保留在药物产品中。实际项目中，很少有因为溶液残留机理出现杂质超标，困扰除杂的情况出现。理由是：只有晶体细小过滤困难情形下，固液分离时才会截留大量的母液，就算是这种比较差的情况，通过多次洗涤液置换，也很容易控制杂质水平。

3、简单情况

简单情况，代表是受结晶“动力学控制”的杂质残留机理，是可以在现有结晶工艺基础上，通过优化结晶工艺来解决杂质超标问题。其包括的杂质残留机理有（图3所示）：晶体间的团聚包裹杂质、晶体内溶液包藏导致杂质残留、晶体缺陷嵌套杂质晶体或者分子。

图3 简单情况杂质残留机理示意图

3.1 简单情况的识别

方法一:现象法

晶体的聚集，在偏光显微镜（PLM）下，可以非常直观的观察到；

溶液在晶体间的包藏，会出现多种杂质均呈现增长的趋势，同时产品会伴随出现溶残超标的情况。

晶体生长过快导致的表面或内部杂质嵌套，会观察到XRD结晶度的明降低，或者在结晶过程中，观察到不同搅拌速度下，产品纯度存在明显差异。

方法二：逐步溶解实验法

实验方法：1，测试API的溶解度；2，将能完全溶解API的溶剂分为5-10份，逐步加入杂质超标的产品中，取样测试杂质含量变化趋势；3，作图，比对后，判断杂质残留类型。

图4 逐步溶解实验示意图

图4是逐步溶解实验判断杂质情况分类，如果逐步加入溶剂过程中，杂质完全溶解完，只有20%-80%的API溶解，则可以判断杂质残留机理是受动力学控制的简单情况。

3.2 简单情况结晶除杂的策略

动力学因素产生的杂质超标的应对策略：降低析晶速率，改善流体力学-搅拌-粒子间相互的碰撞（这个时候可以考虑搅拌形式和搅拌速度的影响）、优化过饱和度曲线（降温速率，滴加速率，加晶种，减少动力学包藏）、循环升降温等。

4、复杂情况

复杂情况，主要指除杂的上限受“热力学控制”的杂质残留机理，是需要综合考虑结晶热力学和结晶动力学的影响的情形。复杂情况的除杂：结晶动力学调整会有作用，但热力学问题决定除杂的上限。复杂情况是除杂中最难的，也是项目中资源、时间精力投入最多的一类情况。先直观看一下，来自真实工业应用中的统计数据：

图5勃林格殷格翰和默克公司统计的难除杂机理归类

图5表格中统计了32组2017-2022 期间，真实工业应用中难除杂的product-impurity组合，其中21组来自勃林格殷格翰，11组来自默克公司。发现困扰药企研发人员的杂质处理问题，均属于除杂中的复杂情况，主要分为两大类：第一类是API和杂质形成共沉淀，这个更多涉及的是热力学溶解度问题；第二类是API-杂质形成“固体溶液”，主要涉及固相混溶问题。

图6 复杂情况残留机理示意图

图6是复杂除杂情况中，杂质残留机理示意图，包括API和杂质形成共沉淀、API和杂质形成固体溶液、API和杂质形成共晶三类情况。这里特别强调下，API 和杂质形成共晶的情形是特例，更多的涉及的在对映异构体杂质的管理，有专门的对映异构体结晶拆分控制异构体杂质。为什么呢？因为实际除杂体系中，杂质的量一般很少，不会和API形成共晶，因为共晶需要API-配体以特定的摩尔比形成在同一晶格中，所以在除杂中，形成共晶的情况，只能是对映异构体之间形成外消旋化合物。

4.1 共沉淀类型识别和结晶除杂策略

共沉淀杂质残留机理是指杂质以“杂质晶体”的形式与API一起析出，从而导致杂质超标。共沉淀类型的杂质超标有个典型经验判断现象：杂质的粒度和晶习可能与API不一致，导致杂质取样检测波动比较大，即样品杂质检测的“均一性”存在明显问题。共沉淀类型细分为两种情况：SLIP1和SLIP2。

4.1.1 共沉淀类型1（SLIP1）的识别和结晶除杂策略

SLIP1杂质残留机理，识别的特点是：溶解性实验中，杂质总是比API先溶解，要么是，杂质的溶解度比API溶解度高，或者杂质含量比较低，逐步增加溶剂过程中，杂质优先于API溶解，杂质在液相中的最大浓度只与溶解度相关。如下图7示意图所示。

图7 SLIP1溶解实验示意图

这种情况下结晶除杂，主要是寻找thermodynamic certainty（热力学上的确定性）；理论上在示意图7的B区操作，控制析晶条件让杂质处于不饱和状态，不成核不析晶，杂质均留在母液中，可以达到完全的除杂。实际工业项目中，这种类型的除杂难度不大，主要需要做好平衡，根据杂质控制水平，平衡好收率和纯度指标！ 

从上面分析看，SLIP1也是通过控制结晶条件就能解决除杂问题呀，那为什么SLIP1划分在复杂情况里呢？

因为实际生产项目中，其实最恼火点，在于SLIP1类型的杂质问题的出现，具有明显的滞后性，往往我们在企业中碰到的是如下这种情况：生产很多批，很多年，产品都是合格的，突然有一批，杂质出现问题，排查原因发现不是工艺参数问题，而是自发成核的原因。之前的很多批的析晶条件，杂质已经到达过饱和状态，但杂质未成核，我们都知道自发成核是随机的，杂质的随机成核并析出，导致杂质超标。具体的案例可以看文献Nordstrom, F. L.*; Sirota, E.*; Hartmanshenn, C. Prevalence of Impurity Retention Mechanisms in Pharmaceutical Crystallizations. Org. Process Res. Dev. 2023, 27, 723−741，其中的二聚体杂质生产多年都是未检出，突然生产一批超标到达0.35w%，排查即为上述分析的原因。

4.2 共沉淀类型2（SLIP2）的识别和结晶除杂策略

共沉淀杂质第二种类型SLIP2，识别的特点是：溶解性实验中，杂质总是比API后溶解，要么是，杂质的溶解度比API溶解度低，或者初始杂质含量比较高。SLIP2类型是我们在项目中不想看到的，因为结晶反而会导致杂质在产品中富集，即重复结晶只会增加产品中杂质的水平，越结晶API中杂质越高，（也就是传说中，越结晶越抽抽的类型），并且初始粗品杂质水平越高，固相中杂质富集程度越严重。

SLIP2逐步溶解实验中，API优先于杂质溶解，如下示意图8所示。特殊条件下，产品完全溶解和杂质完全溶解的Vp体积差距足够大，可以过滤达到除去大部分杂质的目的（图中B区操作）。

图8  SLIP2溶解实验示意图

前面提到，SLIP2类型特点是API先溶解，杂质后溶解。要么是，杂质的溶解度比API溶解度低很多，要么是初始杂质含量比较高。根据这两种情况分别讨论除杂的策略：

第一种情况，杂质溶解度远小于API溶解度，即热力学性质上，杂质非常难溶。热力学的性质没办法改变，只能改善，因此，研究人员常用的更换结晶溶剂体系，除杂效果改善有限。比较有效的除杂策略是考虑更换固体形态（晶型/盐型/共晶/溶剂化合/水合物），从根本上改变杂质和API溶解度的相对差异，或者上下游沟通结晶前端除杂，如合成工艺除去这类特定杂质。

第二种情况, 初始杂质含量特别高导致API全部溶解了，杂质仍然有剩余。如下图9所示示体系，当杂质含量为5.2wt%时，杂质残留机理是SLIP1型，初始杂质含量升高为13wt%时，杂质残留机理则为SLIP2型。

图9  SLIP1和2类型与初始杂质水平相关

针对这种情况，优先考虑，拉通上下游，降低初始杂质水平至一定水平，将SLIP2型转换为SLIP1型；或者更换溶剂体系，不同溶剂杂质和API的溶解差异较大，可以将SLIP2→SLIP1型，然后通过SLIP1型的策略实现杂质的控制，更换溶剂体系需要对应考虑晶型/晶习、收率、溶剂残留等等的影响，这也是“系统性工程”。当然更换固体形态（晶型/盐型/共晶/溶剂化合/水合物）能达到除杂，也是策略之一，但具体选择哪种方法，需要结合项目特点。

4.3 固体溶液的识别和结晶除杂策略

最头疼的情况，是杂质与API形成固体溶液，对于完全混溶系统，即使是微量的杂质（<0.01%）,都会跟着API一起析出来。固态溶液的形成与过饱和度、晶体生长速度等有关，但能否形成固体溶液的决定性因素是API-杂质的混溶性。那怎么识别杂质和API是否形成固体溶液呢？

产业中现象判断法：

（1）杂质含量较低的固体溶液，不同杂质含量的样品，其XRD与纯的API的XRD比较几乎没有明显变化，但其理化性质变化明显：熔点下降、溶解度增加。

（2）杂质与API结构非常相似，是判断形成固体溶液的非常重要的点（如异构体杂质，元素取代杂质等）

存在上述两种情形，又是非常难除去的杂质，就高度怀疑API和杂质形成了固体溶液。

当然，确诊的方法永远是相图，产业界里快速解决项目问题是核心，一般不会去绘制相图，但对于形成固体溶液的体系，通过DSC绘制二元相图在企业实操上是可以接受的（如图10所示），一般观察到趋势即可以停止，物料消耗在mg级别，自动进样DSC对人力上的消耗也相对有限。

图10  部分混溶（左）和完全混溶（右）DSC绘制的二元相图

对于形成固体溶液的体系，更换固体形态（晶型/水合物/溶剂合物/成盐），改变晶体-杂质的混溶性质（切换热力学赛道），是解决问题最根本的方法。那常用的更改溶剂体系、优化结晶工艺、循环升降温等动力学操作对除杂有效果吗？答案是肯定，但不能根本上解决问题，或者说只能特定条件下解决除杂问题。

这里有一个典型的案例：日本上市的一个药物恩扎鲁胺，API结构和难除杂质结构非常接近，只有S和O取代的差异（图11）。

图11 恩扎鲁胺API(左)和难除杂质（右）

恩扎鲁胺存在多晶型现象，上市晶型采用的是无水晶型R1，无水晶型R1在异丙醇中悬浮打浆可以得到异丙醇溶剂化物R3。研究发现，R1会与氧取代杂质形成稳定的固体溶液，甚至会形成高达50%的杂质含量的固体溶液（stable solid solution up to 50%），但是R3不会与该杂质形成固体溶液。对于初始杂质含量不太高的情形，R1晶型的话，需要重结晶三次，杂质才在限度以内（似乎能接受）；而制备成R3晶型的话，一次限度就合格了。如果到结晶端杂质含量非常高，制备R1多次重结晶或者优化结晶工艺，除杂效果会大大减弱，但制备成R3晶型，依然可以很好的除杂效果。

5、结语

在企业，解决问题永远会有很多条路径。是不是100%完美的技术方案，不重要！速度+质量的平衡，适合此时此地技术背景，很重要！

参考文献

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