内容提要：二类含壳聚糖敷料作为创面敷料中的一类产品，包括含壳聚糖、改性壳聚糖不同结构形态和临床预期用途的产品。作为与创面直接接触的医疗器械产品，在注册申报过程中进行生物学评价是必不可少的环节。通过对二类含壳聚糖敷料产品的实例分析，探讨在注册技术审评中运用标准GB/T 16886.1-2022《医疗器械生物学评价 第1 部分：风险管理过程中的评价与试验》进行评价的问题，为相关产品研发、注册及审评提供参考。

关 键 词：二类含壳聚糖敷料 生物学评价 技术审评

创面敷料是临床广泛应用的医疗器械产品，主要用于各类创面的护理，在医疗器械分类目录中其分类编码为14（注输、护理和防护器械）-10（创面敷料），在三级目录类下面又细分为创面敷贴、粉末敷料、凝胶敷料、液体/ 膏状敷料、纤维敷料、泡沫敷料以及含壳聚糖敷料等12 个大类。这些大类主要是根据产品外观形态或形式进行划分，仅有碳纤维和活性炭敷料、含壳聚糖敷料这两类是依据材质划分出来的。其中，含壳聚糖敷料由于材料本身所具有的一些特性，以其为原材料制成的含壳聚糖敷料产品也备受关注，敷料所含的壳聚糖包括壳聚糖和壳聚糖衍生物，结构上也有敷贴、粉末/ 颗粒、纤维、无纺布、海绵等多种不同形式。作为与人体创面直接接触的医疗器械产品，在产品研制和注册申报过程中进行生物学评价是必不可少的环节。GB/T 16886系列标准是医疗器械生物学评价的主要依据，但在具体应用过程中除应考虑的生物学风险评定终点外，还涉及诸多具体的试验项目、试验方法的选择及对试验结果的分析评定等复杂问题。研究和总结分析不同二类含壳聚糖敷料的生物学评价，对于此类产品的研制、注册和技术审评具有重要意义。

1.生物学评价途径及终点

二类含壳聚糖敷料产品的生物学风险评价途径与其他医疗器械一样，可以采用生物学试验的方式，也可以通过医疗器械/ 材料与市售产品的等同性比较的方式进行评价。按照GB/T 16886.1-2022《医疗器械生物学评价 第1 部分：风险管理过程中的评价与试验》[1]，医疗器械生物学评价的系统方法框图中，在明确产品与患者接触并获得物理/ 化学信息后，需要从材料（配方）、加工过程和灭菌（类型/过程细节）、几何和物理特性、人体接触方式和临床使用方式四方面论证与市售器械的等同性。以材料等同性的论证为例，这个等同性不仅仅是指比较两个材料本身在化学名称或组成等方面是否是完全等同或一致，而是需要从毒理学方面的等同性进行具体的比较，通过论证材料本身及其生产过程中可能引入的物质（如反应物、催化剂、溶剂、加工助剂、染色剂等），以及这个过程中产生的各种副产物，在毒理学或者生物安全性方面能否不低于临床已使用的同类材料，这些论证均需要提供相应的支持性数据资料。对于大多数注册申请人来讲，如通过与其他企业上市产品进行等同性比较的方式评价，在实际操作过程中需要做的研究工作量巨大，且申请人自身或其委托进行评价的机构要具备相当高的分析测试能力及技术水平，而且整个评价过程和最终结果也具有一定的不确定性。因此，目前注册申请人采用等同性比较方式进行评价多局限于与自家生产的上市产品进行比较，通过生物学试验进行评价仍是现阶段主要依赖的评价途径。

采用生物学试验方式进行评价，首先需要确认产品与人体接触的性质与时间。根据《医疗器械分类目录》，二类含壳聚糖敷料的临床预期用途被限定为“非慢性创面”的应用，且要求“所含成分不可被人体吸收”。因此，该产品与人体接触时间均<30d，包括短期接触（≤24h）和长期接触（>24h，≤30d）两种情形，与人体接触性质属于表面接触医疗器械中的破裂或损伤表面，依据GB/T 16886.1-2022，在已知产品物理和/ 或化学信息前提下，生物学风险评定终点短期接触产品应包含细胞毒性、致敏反应、皮内反应、材料介导的致热性、急性全身毒性反应，与人体长期接触的产品在此基础上还应增加亚急性毒性和植入反应。相较原标准GB/T 16886.1-2011，可以看到对短期接触产品生物学评价项目增加了致热性、急性全身毒性反应，长期接触产品增加了致热性、急性全身毒性、亚急性毒性和植入反应。

2.生物学评价实例及分析

二类含壳聚糖敷料在外观形态上涵盖了敷贴、粉末/ 颗粒、纤维、无纺布、泡沫等不同形式，所含壳聚糖包括壳聚糖本身以及壳聚糖衍生物，其中敷料产品中所含壳聚糖衍生物以羧甲基壳聚糖占比较高。本文通过对不同类型含壳聚糖敷料的生物学试验项目实例进行分析，从试验样品制备、各试验项目具体方法的选择以及对试验结果的评价进行分析总结。在进行生物学试验时应依据GB/T 16886.12-2017《医疗器械生物学评价 第12 部分：样品制备与参照材料》[2] 进行样品制备，而试验样品应适用于特定的试验系统，不同产品和不同试验项目及产品本身具体情况考虑采用适当的制备方法。在具体试验方法的选择上，不同试验项目下一般会包含多个试验方法，应结合产品本身特性、实际的临床应用及试验方法的可操作性等方面综合考虑，选取适宜的方法。生物学试验结果的评价也是一个重要的过程，有时从生物学试验单一的结果方面并无法完成对产品安全性和有效性评价，还需结合材料或产品本身特性以及该类产品的临床应用史等方面进行综合评价。

2.1 体外细胞毒性试验

体外细胞毒性试验可以用来评估医疗器械产品对细胞的毒性，反映医疗器械产品的生物相容性问题，该试验方法和结果判定的依据为标准GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价 第5 部分：体外细胞毒性试验》[3]。该试验主要通过将医疗器械与体外培养的细胞接触，观察和测量细胞的生存率、形态变化、代谢活性等指标来评估其对细胞的影响。体外细胞毒性试验分为三类，分别是浸提液试验、直接接触试验和间接接触试验。依据试验的选择应尽量模拟临床使用情况或严于临床条件的原则，含壳聚糖敷料通常采用浸提液试验或直接接触试验这两种方式对细胞毒性进行定量评价。而间接接触试验与临床实际使用接触方式不同，且仅用于细胞毒性的定性评价，通常用于材料的筛选，对于采用与已上市产品相同材质的产品，评价时一般不采用此试验方法。

以敷贴形式的含壳聚糖敷料为例，其通常包含涂胶基材、含壳聚糖的敷芯和可剥离的保护层组成。这三个组成部分与人体接触的性质各不相同：可剥离的保护层不与人体接触，涂胶基材使用时仅与创面周围的完整皮肤接触，只有敷芯是与创面直接接触的。因此对这三个组成部分应分别进行评价，其中可剥离的保护层不与人体接触可免于生物学评价，涂胶基材和敷芯在通过试验进行评价时可采用浸提液试验、直接接触试验。

浸提液试验-MTT法是在医疗器械体外细胞毒性试验中最常采用的方法。在壳聚糖敷贴产品生物学试验实例中，样品制备使用细胞培养液（含10%胎牛血清的最小必需培养基）进行浸提，由于含血清培养液能支持细胞生长且具有极性和非极性介质特性，所以可采取单一介质浸提：取壳聚糖敷贴的敷芯，基于3cm2/mL的比例（额外吸收试验样品细胞培养液吸收量）；取壳聚糖敷贴的粘贴边，基于6cm2/mL的比例，在细胞培养液中于（37±1）˚C的温度下，以60r/min的振荡频率浸提（24±2）h 制备的浸提液作为试验液。由于阳性对照采用10%二甲基亚砜溶液，阴性对照为聚乙烯（基于6cm2/mL比例的浸提液），介质对照为不含试验样品的细胞培养液。试验系统中细胞株采用小鼠成纤维细胞L929，用细胞培养基制备细胞悬浮液，调整细胞浓度为1×105个/mL，加入96 孔细胞培养板中，置于细胞培养箱（5%CO2，37˚C）中孵育24h，形成近汇合单层细胞，吸出原培养基后分别在培养板中加入试验液（产品浸提液）、阴性对照液（聚乙烯浸提液）、阳性对照液（10%二甲基亚砜溶液）以及介质对照液（细胞培养液）。将该培养板放入细胞培养箱中培养2h，然后在显微镜下观察细胞形态。之后移去培养基加入MTT溶液，继续在培养箱中培养2h，然后将孔内液体弃去加入异丙醇振荡，用酶标仪测定吸光度（波长570nm），然后通过公式计算存活率：存活率（%）=100× 各供试组（试验组、阴性对照组、阳性对照组）吸光度/ 介质对照组吸光度。试验结果包括显微镜下各供试组细胞形态的观察及存活率的定量检测两部分。最终结果显示试验组绝大部分细胞形态正常，细胞存活率为88%；阴性对照组绝大部分细胞形态正常，细胞存活率为95%；阳性对照组细胞层几乎完全破坏，细胞存活率为2%。从试验结果可看出，试验组细胞存活率≥70%，无潜在细胞毒性。

对于所含壳聚糖为羧甲基壳聚糖的敷料产品，其体外细胞毒性与浸提液浓度密切相关，并受羧甲基壳聚糖的取代位置及羧基化程度影响[4]。羧甲基壳聚糖具有水溶性，也可溶解于含血清培养基中，在YY 0953-2015《医用羧甲基壳聚糖》[5] 标准中，其生物学性能中明确用生理盐水配制成含羧甲基壳聚糖2mg/mL的溶液，取此溶液进行细胞毒性试验，但在更新后的YY/T 0953-2020《医用羧甲基壳聚糖》[6] 标准中删除了生物学评价的具体要求及试验方法。依据GB/T 16886.12-2017，采用0.2g/mL的比例进行浸提，其试验结果可能会表现出较高的细胞毒性。这与羧甲基壳聚糖本身的溶解性相关，其浸提液实际上为羧甲基壳聚糖溶液，较高的浓度会导致细胞处于高渗状态，抑制细胞其生长。因此，如在较高浸提浓度下试验结果表现出具有潜在细胞毒性时，需要注册申请人对结果进行分析。可选取已上市同类产品进行平行试验比对的方法，通过相同试验条件下及浸提液逐级稀释后细胞存活率的对比进一步说明产品生物相容性是否可接受。

2.2 刺激与皮肤致敏试验

刺激与皮肤致敏试验方法和结果判定的依据为GB/T 16886.10-2017《医疗器械生物学评价 第10 部分：刺激与皮肤致敏试验》[7]。刺激试验分为体外刺激试验和体内刺激试验，但目前体外皮肤刺激试验仅用于纯化学物，不适用于医疗器械浸提液。因此，医疗器械的刺激试验还是采用体内刺激试验，目前基本上都是通过动物皮肤/ 黏膜刺激试验和动物皮内反应试验进行评价。

敷贴形式的含壳聚糖敷料，由于其敷芯和可粘贴背衬与人体接触性质不同，在刺激试验时可采用不同的试验方法。敷芯作为与创面直接接触的部分，通常采用皮内反应试验以评价产品产生刺激反应的潜能。而可粘贴的背衬只与创面周围的完整皮肤接触，可以选用皮肤刺激试验进行评价。

敷芯进行皮内反应试验时，试验动物采用3 只体重不低于2kg 的家兔（新西兰白兔）。制备浸提液时分别使用0.9%氯化钠注射液（Sodium Chloride，SC）作为极性浸提介质、棉籽油（Cottonseed Oil，SCO）作为非极性浸提介质，浸提比例和方法与体外细胞毒性试验一致，但浸提时间增加为（72±2）h。这是由于细胞毒性试验中采用的浸提介质含有血清，长时间浸提会影响其稳定性，性质相对稳定的浸提介质SC和SCO 通常按照GB/T 16886.12-2017中推荐的加严浸提条件（37±1）˚C、（72±2）h 进行。试验空白对照采用不含试验样品的浸提介质以相同的方法制备。皮内反应试验前4~18h对家兔进行称重，并将其背部脊柱两侧的被毛彻底除去作为试验和观察部位，按照GB/T 16886.10-2017 注射点排列要求，分别皮内注射0.2mL的SC试验液、SCO 试验液、SC 对照液、SCO 对照液。在注射完成后立即观察注射点即时反应，然后观察并记录注射后（24±2）h、（48±2）h、（72±2）h 3 个时间点注射部位的红斑和水肿反应，并按照GB/T 16886.10-2017 中的标准记分。在（72±2）h 评分后，分别将每只动物试验样品或空白对照3个时间点的全部红斑和水肿的记分相加，再除以15，通过计算得出每只家兔试验样品或空白对照的记分。然后将3 只家兔记分相加除以3，得出每一试验样品或空白对照的总平均记分。试验样品的记分减去空白对照的记分可得出试验样品最终记分，如试验样品最终记分≤1.0，则符合试验要求。壳聚糖敷贴的敷芯试验结果为SC和SCO试验液的家兔皮内反应最终记分均≤1.0，说明敷芯皮内反应的试验结果是符合标准要求的。

对于可粘贴的背衬部分，采用皮肤刺激试验来评价产生刺激反应的潜能。试验动物也是采用3 只体重不低于2kg 的家兔（新西兰白兔），将试验样品（壳聚糖敷贴的粘贴边）单次直接接触家兔背部脊柱两侧的皮肤24h，将纱布块同法接触作为对照。于接触后（24±2）h、（48±2）h、（72±2）h，对接触部位红斑、水肿记分，计算原发性刺激指数。试验结果为壳聚糖敷贴的粘贴边家兔原发性刺激指数为0.0，说明可粘贴背衬的皮肤刺激是符合要求的。

皮肤致敏试验是用于测定产品潜在皮肤致敏性的动物试验。目前该试验有三种方法：小鼠局部淋巴结试验、豚鼠最大剂量试验、封闭式贴敷试验。这三种方法中最大剂量试验是最敏感的方法，含壳聚糖敷料产品通常采用此试验方法进行评价。壳聚糖敷贴试验液分别采用SC、SCO 浸提，比例与体外细胞毒性试验一致，（37±1）˚C条件下振荡浸提（72±2）h。阳性对照为1- 氯-2,4- 二硝基苯，介质对照采用不含试验样品的浸提介质（SC、SCO）以和试验液相同的方法制备，共取30 只豚鼠作为试验动物进行试验。试验分为皮内诱导阶段、局部诱导阶段和激发阶段。将SC和SCO两种试验液分别注射于试验组豚鼠背部剃毛区，并用浸透了试验液的滤纸片进行封闭固定，用以诱导皮肤致敏反应。试验激发阶段在局部诱导完成后14d 进行，把试验液浸透的滤纸片封闭固定于试验组动物诱导阶段其他未试验的部位- 腹部剃毛区，封闭贴敷（24±2）h 后除去，观察并记录在去除滤纸片后24h和48h所有动物激发部位皮肤情况，按Magnusson和Klingman分级标准进行描述并分级，对照组动物同法操作。试验结果为壳聚糖敷贴SC和SCO试验液均未导致豚鼠出现皮肤致敏反应。

2.3 热原试验与急性全身毒性

目前，针对热原检测的试验主要有两种，分别是热原检查法（家兔法）和细菌内毒素法（鲎试剂法），细菌内毒素是产生致热反应的因素，但材料和其他物质也可能会导致致热性，细菌内毒素法无法全面反映医疗器械的致热性，因此热原检查法（家兔法）被作为仲裁法。

在壳聚糖敷贴热原试验依据的是标准GB/T 16886.11-2021《医疗器械生物学评价 第11 部分：全身毒性试验》[8]，试验方法则按照《中华人民共和国药典》2020 年版四部通则1142 热原检查法进行，确定样品试验液经静脉注射家兔后是否会导致热原反应。由于壳聚糖敷贴只有敷芯与创面接触，所以仅需对敷芯进行热原试验。浸提介质为SC，基于3cm2/mL的比例，（37±1）˚C条件下振荡浸提（72±2）h。试验时首先要选取可供热原检查用的家兔3 只，需每30min 测量并记录试验动物的直肠温度，共测量8 次。只有8 次体温均为38˚C~39.6˚C，且最高与最低体温相差不超过0.4˚C的家兔才可使用。试验时按照10mL/kg的剂量，经耳缘静脉分别对3 只家兔进行样品试验液的注射，注射后3h 内每隔30min测量家兔直肠温度并记录。试验结果3只家兔体温升高均低于0.6˚C，并且3 只家兔升温总和低于1.3˚C，3h 观察时间内家兔体温变化在《中华人民共和国药典》可接受的范围内，壳聚糖敷贴（敷芯）没有致热性。

急性全身毒性试验是用于评价在短时间内（通常为24h内）一次或多次接触试验样品后在72h 内发生不良反应的情况。对于壳聚糖敷贴产品，也是仅需评价敷芯部分，与完整皮肤接触的粘贴背衬是无须进行该试验的。试验样品制备也是采用浸提液，浸提介质分别使用SC和SCO，浸提比例和条件与热原试验一致，对照组采用不含试验样品的浸提介质（SC和SCO）以相同的方法制备。依据GB/T 16886.11-2021《医疗器械生物学评价 第11 部分：全身毒性试验》，试验动物使用昆明小鼠20 只，2 个试验组和2 个对照组，每组5 只小鼠，试验前先将小鼠标记并称重。采用腹腔注射（IP）法，按照50mL/kg的剂量分别注入SC试验液、SCO试验液、SC对照液、SCO对照液，腹腔注射完成后立即观察小鼠所有行为表现，然后观察注射后4h、24h、48h、72h 小鼠的行为表现和观测有无死亡动物，并记录小鼠在24h、48h、72h 时的体重。试验结果为试验组与对照组小鼠均未见死亡和异常症状，所有动物体重均有增加，试验液给予试验小鼠后未见明显急性全身毒性反应。

3.小结

生物学评价是确保二类含壳聚糖敷料产品安全性和有效性所必须进行的研究内容，目前主要依据GB/T 16886 系列标准以开展相关生物试验的方式进行。但在具体实施过程中，对于试验项目、试验方法及试验条件的选择方面，由于医疗器械产品种类繁多，标准无法细化到每个产品，还是需要研究者根据产品情况具体分析和选择。本文选取二类含壳聚糖敷料的生物学评价实例，列举了体外细胞毒性试验、刺激与皮肤致敏试验、热原试验、急性全身毒性试验采用的具体试验方法和结果，并进行相应的分析，希望可以为二类含壳聚糖敷料产品的研制、注册和技术审评提供一定参考。