前言

ICH《BIOANALYTICAL METHOD VALIDATION AND STUDY SAMPLE ANALYSIS》M10（以下简称“ICH M10”）自2022年5月24日颁布至今，已有两年时间。本期，我们根据ICH M10、NMPA 2020版《中国药典》9012部分指导原则（以下简称“NMPA 2020版”）以及FDA Bioanalytical Method Validation（以下简称“FDA BMV 2018版”）三者对于生物分析方法验证以及样品分析的相关具体要求，结合两年中ICH M10的实施经验，对于色谱法生物分析方法验证及样品分析的实施细则进行进一步解析，以更加深入了解指导原则中的内容。

1、方法的选择性和特异性

ICH M10中对方法的“选择性”和“特异性”进行了明确区分，定义如下：

选择性：

Selectivityis theability ofan analytical method to differentiateand measurethe analytein the presence of potential interfering substances in the blank biological matrix.

选择性是分析方法在空白生物基质中存在潜在干扰物质的情况下区分和测定待测物的能力。

特异性：

Specificity is the ability of a bioanalytical method to detect and differentiate the analyte from other substances, including its related substances (e.g., substances that are structurally similar to the analyte, metabolites, isomers, impurities, degradation products formed during sample preparation, or concomitant medications that are expected to be used in the treatment of patients with the intended indication).

特异性是生物分析方法检测和区分待测物与其他物质的能力，包括相关物质（例如与待测物结构相似的物质、代谢物、异构体、杂质、样品制备过程中形成的降解产物，或预期目标适应症患者的合并用药）。

FDA 2018版BMV和中国药典2020版中对于选择性和特异性的描述通常放在同一章节，未作明显区分。因此，按照ICH M10规则汇报时，需要将对应的实验结果按照“选择性”和“特异性”分开汇报。

2、分析批容量

ICH M10中关于“分析批容量”考察的规定如下：

To enable the evaluation of any trends over time within one run, it is recommended to demonstrate accuracy and precisionof the QCs over at least one of the runs in a size equivalent to a prospective analytical run of study samples.

为了能够评估一个分析批内随时间变化的任何趋势，建议至少在一个分析批中证明质控样品的准确度和精密度，该分析批的大小应与研究样品预期分析批大小相当。

中国药典2020版中规定：

为评价一个分析批中不同时间的任何趋势，推荐以质控样品分析批来证明准确度，其样品数不少于一个分析批预期的样品数。

从上述两个法规的规定中可以看出，ICH M10除了要求考察质控样品的准确度，还需考察精密度。因此分析批容量需在一个准确度和精密度批次中考察才能满足此要求。

3、批内准确度和精密度

ICH M10中关于“批内准确度和精密度”考察的规定如下：

Within-run accuracy and precision should be evaluated by analysing at least 5 replicates at each QC concentration level in each analytical run.

批内准确度和精密度应通过在每一分析批、对每个浓度水平的质控样品进行至少5个样品分析来评估。

中国药典2020版中规定：

对于验证批次精密度，至少需要一个分析批的4个浓度，即定量下限以及低、中、高浓度，每个浓度至少5个样品。

FDA 2018版BMV中也强调了每个浓度考察5个重复：

A & P should be established with at least three independent A& P runs, four QC levels per run (LLOQ, L, M, H QC), and ≥ five replicates per QC level.

按照以往对于5 replicates（5个重复）的理解，考察时提取5个重复的质控样品并满足准确度和精密度的要求即可，对最终参与计算的测定值个数未作明确要求。此次结合ICH M10中的规定“by analysing at least 5 replicates”，对于每个浓度的质控样品，其最终参与计算的测定值建议应不少于5个。举例：如每个浓度考察6个重复的质控样品，则因为分析原因导致无法准确获得最终测定值的质控样品每个浓度不能多于1个，否则无法满足至少5个测定值参与最终计算的要求。

4、稀释可靠性

ICH M10中关于“稀释可靠性”的规定如下：

Dilution QCs should be prepared with analyte concentrations in matrix that are greater than the ULOQ and then diluted with blank matrix. At least 5 replicates per dilution factor should be tested in one run to determine if concentrations are accurately and precisely measured within the calibration range. The dilution factor(s) and concentrations applied during study sample analysis should be within the range of the dilution factors and concentrations evaluated during validation. The mean accuracy of the dilution QCs should be within ±15% of the nominal concentration and the precision (%CV) should not exceed 15%.

稀释质控样品的浓度应大于ULOQ，采用空白基质对样品进行稀释，每个稀释因子至少5个测定值，并在同一批次进行检测，以确保检测浓度在校准曲线范围内被准确、精密地测量。研究样品分析过程中所用稀释因子和浓度应该处于方法学验证的稀释因子和浓度范围内。稀释质控的平均准确度应在标示值的±15%之内，精密度（%CV）不应超过15%。

中国药典2020版中规定：

样品稀释不应影响准确度和精密度。应该通过向基质中加入分析物至高于定量上限，并用空白基质稀释该样品（每个稀释因子至少5个测定值），来证明稀释的可靠性。准确度和精密度应在±15%之内，稀释的可靠性应该覆盖试验样品所用的稀释倍数。

FDA 2018版BMV中规定：

QCs for planned dilutions, 5 replicates per dilution factor.

按照以往对于5 replicates（5个重复）的理解，考察时提取5个重复的稀释质控样品并满足准确度和精密度的要求即可，对最终参与计算的测定值个数未作明确要求。此次结合ICH M10和中国药典2020版，对于最终参与计算的稀释质控样品的测定值建议应不少于5个。举例：如每个稀释因子考察6个重复的稀释质控样品，则因为分析原因导致无法准确获得最终测定值的稀释质控样品不能多于1个，否则无法满足至少5个测定值参与最终计算的要求。

5、稳定性

ICH M10中关于稳定性的规定如下：

1、Stability of the analyte in the matrix is evaluated using low and high concentration QCs. Aliquots of the low and high QCs are analysed at time zero and after the applied storage conditions that are to be evaluated.

采用低浓度和高浓度稳定性质控样品考察基质中待测物的稳定性。低浓度和高浓度稳定性质控样品应分别在零时和考察条件下放置后进行评价。

此处强调了稳定性质控样品需在零时刻进行评价，该要求在中国药典2020版和FDA 2018版BMV中未明确规定。因此，在稳定性样品配制和分装的过程中需注意考察零时刻的结果。

2、If the concentrations of the study samples are consistently higher than the ULOQ of the calibration range, the concentration of the high QC should be adjusted to reflect these higher concentrations.

如果研究样品的浓度持续高于校准曲线的ULOQ，则应调高稳定性质控样品的浓度，以反映这些较高浓度样品的稳定性结果。

此处强调了稳定性质控样品需要涵盖“持续高于ULOQ的研究样品浓度”，该要求在中国药典2020版和FDA 2018版BMV中未明确规定。因此，建议方法验证中除了考察低和高质控样品的稳定性外，酌情考虑增加稀释质控样品的稳定性用于覆盖超出ULOQ部分的研究样品浓度。

6、重新进样重现性

ICH M10中关于“重新进样重现性”的规定如下：

Reinjection reproducibility is assessed by reinjecting a run that is comprised of calibration standards and a minimum of 5 replicates of the low, middle and high QCs after storage. The precision and accuracy of the reinjected QCs establish the viability of the processed samples.

重新进样的重现性通过由储存后的校正标样和至少5个低浓度、中浓度和高浓度QC组成的分析批重新进样来评估，以重新进样的QC样品的精密度和准确度确定处理后样品重新进样的可行性。

ICH M10中对于重新进样重现性的考察单独进行了描述，而在NMPA 2020版和FDA 2018版BMV中无明确规定。同时，和其他稳定性考察的低和高两个浓度的质控样品要求不同，重新进样重现性则强调需要考察低、中、高三个浓度，在实际考察时此处需引起注意。

7、研究样品重分析

ICH M10中关于“研究样品重分析”的规定如下：

Possible reasons for reanalysis of study samples, the number of replicates and the decision criteria to select the value to be reported should be predefined in the protocol, study plan or SOP, before the actual start of the analysis of the study samples. For study samples in which multiple analytes are being analysed, a valid result for one analyte should not be rejected if the other analyte fails the acceptance criteria.

The number of samples (and percentage of total number of samples) that have been reanalysed should be reported and discussed in the Bioanalytical Report.

研究样品分析开始前，应该在方案、研究计划或SOP中预先规定重新分析研究样品的理由、重复次数以及报告值的选择标准。对于正在分析多种待测物的研究样品，如果其中一种待测物不符合接受标准，不应拒绝另一种待测物的有效结果。

应在生物样品分析报告中提供并讨论重分析样品的数量（以及占样品总数的百分比）。

ICH M10要求汇报“重分析样品的数量以及占样品总数的百分比”，但在中国药典2020版和FDA 2018版BMV中无此要求。因此，汇报时需注意提供该部分信息。

结语

综上所述，我们对于ICH M10中容易被忽略或者同以往执行规则有细微差异的相关规定结合两年多的实施经验做了详细解读并提供了建议的解决方案。ICH M10作为统一的行业指导原则，对于相关考察项的执行和汇报有更具体和详细的要求，生物分析检测实施过程中对相关细节把控需结合实际进行解读后执行。