问：我新建了一种液相分离方法，但该方法似乎对 pH 值的变化非常敏感。这是一个简单的反相色谱方法，我没有使用任何的离子对试剂。我发现保留时间每天都有很大的变化，我可以确认 pH 值确实存在微小变化。问题出在哪里？

答：从您对问题的描述来看，您所处理的是：pKa 值接近流动相 pH 值的离子型化合物。因此，您需要处理两种保留时间明显不同的化合物。例如，这可能是质子化和非质子化形式的酸。带电形式化合物的保留因子要比不带电形式的要小得多。两者之间的平衡取决于 pH 值。流动相 pH 值的微小变化会改变化合物两种形式的比例，从而影响保留时间。

因此，有必要严格控制 pH 值。由于您已经做了一些实验，您可能已经获得了足够的信息来定量了解保留时间与 pH 值的关系。如果还没有，可以做一些对照实验来获得这方面的知识。此外，您还可以查看该方法的历史记录。这些信息应该是在方法稳健性测试过程中产生的。一旦有了依赖性，您就需要决定您可以接受的保留时间波动范围。然后计算 pH 值调整的精度。即使在困难的情况下，±0.02 pH 单位的精度也应该足够了。

问：很难精确调节 pH 值。如果只加一点点酸，pH 值就会发生很大变化。

答：不幸的是，这表明您使用的不是缓冲液。缓冲液的定义是：它可以缓冲少量酸或碱的 pH 值，也就是说，加入酸或碱后，pH 值的变化应该很小。这种维持 pH 值的能力称为缓冲能力。它取决于缓冲液的浓度和缓冲离子的 pKa。在缓冲离子的 pKa 值时，缓冲能力最大。表 1 给出了 HPLC 中常用的一些缓冲液的 pKa。请注意，它们是在水中测量的，没有添加有机溶剂。加入有机溶剂后，pKa 值会发生变化。但一般来说，包括您的分析物在内的所有化合物的 pKa 都会发生相同的偏移。

对于 HPLC 中常用的缓冲液浓度，缓冲液的 pH 值应保持在缓冲离子 pKa 值附近 ±1.5 个 pH 单位的范围内。对于 5 mM（毫摩尔）以下的极稀释缓冲液，您可能需要将范围进一步缩小到 pKa 附近的 ±1 个 pH 单位。

如表 1 所示，磷酸的 pKa 值约为 2 和 7。其中 4.5 处于中间位置，磷酸在此 pH 值下没有任何缓冲能力。要缓冲 4.5 的 pH 值，您需要使用不同的缓冲剂，例如乙酸。

同样，pH 值为 7 的乙酸铵溶液也不是缓冲液，而是盐溶液。乙酸铵“缓冲剂”的使用已变得很流行，因为乙酸铵易挥发，可与质谱检测器一起使用。但在 pH 值为 7 时，乙酸铵并不是缓冲剂，除非出于其他原因需要使用盐，否则流动相中最好不要使用乙酸铵。

表 1.常用缓冲液的 pKa 值（25°C 时）

问：如何改进方法？

答：如果使用的缓冲液 pH 值不合适，只需从表 1中选择更合适的缓冲液即可。通常情况下，更换缓冲液不会影响分离效果，否则您可能需要进行额外的调整。

有时，由于检测器的限制，无法更换缓冲液。我们已经提到过质谱仪需要使用挥发性缓冲液。基于羧酸的缓冲液不太适合低紫外检测，因为本底吸收较高，会导致噪音过大。如果找不到与检测兼容的缓冲液，那就麻烦了。您要么可以接受现有的保留变异性，要么就应该在所使用缓冲液的 pKa 值或接近 pKa 值的条件下重新制定方法。这显然会大幅改变色谱图，您需要从头开始重新优化方法。这可能不是一个好消息，但从长远来看，您会得到更好的结果。

我通常建议在方法开发过程中首先选择缓冲液，从而确定一般的 pH 值范围，然后利用溶剂选择性对分离进行微调。这种方法开发策略既快速又高效。它还能避免在缓冲液 pH 值方面出现错误。在下一次方法开发中，您不妨考虑一下这种方法。