线性与范围验证是方法验证中的重要组成部分，线性与范围的选择虽然在ICHQ2(R2):VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES、中国药典2020年版9101《分析方法验证指导原则》、《药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统》等指导原则中有解释和举例说明，但是在实际运用的过程中，不同人员仍然对线性与范围浓度点的选择有不同的理解，比如“自身对照法中，主成分线性与范围验证是否应该覆盖最大杂质浓度”等问题，本文结合对相关法规的理解和注册检验、补充研究等经验，提出方法验证中线性与范围选择时需注意的问题，有不妥之处，希望和大家一起探讨。

对于杂质检查，ICHQ2(R2)中列表指出分析方法常见用途的可报告范围为“报告阈值至规定产品标准限度的120%”、“为建立线性，建议在范围内适当分布至少5种浓度”[1]。《分析方法验证指导原则》中指出“应在设计的范围内测定线性关系。可用同一对照品贮备液经精密稀释,或分别精密称取对照品,制备一系列对照品溶液的方法进行测定，至少制备5个不同浓度水平”[2]。药品GMP指南中指出“杂质的定量测定：范围应根据初步测定数据,拟订为规定限度的±20%”[3]。上述规定如何理解和实施呢，我们以一个例子来进行论证。

举例：某供试品浓度为1mg/ml，对照溶液为1µg/ml，限度为“供试品溶液中如有杂质峰，杂质A峰面积不得过对照溶液的主峰面积（0.1%）；杂质B峰面积不得过对照溶液的主峰面积的2倍（0.2%）；杂质C峰面积不得过对照溶液的主峰面积的20倍（2.0%）；其他单个杂质不得大于对照溶液的主峰面积的2倍（0.2%）；各杂质校正后峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的30倍（3.0%）。（假设各杂质定量限/报告限均为0.05%）”关于验证时的线性范围常见以下几种选择：

A：杂质A、杂质B与杂质C均为0.5µg/ml~24µg/ml。

B：杂质A：0.5µg/ml~1.2µg/ml、杂质B：0.5µg/ml~2.4µg/ml、杂质C：0.5µg/ml~24µg/ml。

C：主成分：0.5µg/ml~24µg/ml

D：主成分：0.5µg/ml~2.4µg/ml

E：主成分：0.5µg/ml~1.2µg/ml

本案例仅用于线性与范围讨论使用，不用于论证其他问题。

关于主成分和杂质ABC的线性范围：有些人选择AC，主成分和各杂质使用一个浓度范围，涵盖报告限度至最大杂质限度浓度的120%，这样操作方便快捷，配制一份贮备液，逐级稀释，即可得到各线性浓度点。有些人选择BE，因为ICHQ2(R2)中明确规定报告范围为“报告阈值至规定产品标准限度的120%”，所以杂质ABC的线性浓度点不同，应该使用各自限度的120%，而不是统一使用最大杂质浓度的120%；主成分只需要验证至对照溶液浓度的120%。可能有些人习惯于其他选择。

首先我们探讨选项A与选项B，也就是关于杂质A、B、C的线性范围，ICHQ2(R2)中规定报告范围为“报告阈值至规定产品标准限度的120%”，例如我们进行残留溶剂方法验证时，甲醇限度0.3%，乙醇限度0.5%，通常做的范围为：甲醇LOQ~0.45%，乙醇LOQ~0.75%，而不是甲醇和乙醇都是LOQ~0.75%，而关于杂质也是同样的道理，应该做的验证范围为“报告阈值至规定产品标准限度的120%”。

对于主成分的浓度范围选择，首先我们应该排除选项E：0.5µg/ml~1.2µg/ml，因为标准中其他单杂限度为0.2%，我们应该使用主成分代替未知杂质进行其线性与范围验证，证明其在0.2%限度检测时的准确性，所以线性与范围应该包括2µg/ml。那么剩余的两项，我们是选择C：0.5µg/ml~24µg/ml还是D：0.5µg/ml~2.4µg/ml呢？

我们知道，液相色谱仪紫外检测器遵循循朗伯-比尔定律，适用于检测低浓度物质，在浓度高时，会发生偏移。Pedro Lopez Garcia 在Analytical Method Validation一文中指出，以浓度的对数为横坐标，以峰面积/浓度为横坐标，在浓度较高时，数据会产生负偏差，典型图谱见图1，而这样的偏差在线性相关系数等评价数据中难以被发现。

图1 高浓度产生的数据偏差

我们将上述案例中的主成分进行线性试验，数据覆盖供试品浓度的0.05%~120%，具体数据见表1，以浓度的对数为横坐标，以峰面积/浓度为横坐标，图谱见图2，其数据如果使用序号1~5数据进行线性数据统计，范围为0.5µg/ml~2.4µg/ml（接近选项D），相关系数r为0.9999，线性线性方程为y = 0.3929x + 0.0189；如果使用序号1~8数据进行线性数据统计，范围为0.5µg/ml~25µg/ml（接近选项C），相关系数r为1.0000，线性线性方程为y = 0.3766x + 0.0489，2组数据相关系数均符合要求，但是线性方程斜率有约4%的偏差；而我们实际使用建立的标准对样品进行检测时，使用自身对照法，限度制订为“不得过对照溶液的**倍”，基准是对照溶液，只进一个自身对照溶液，也就是使用单点法统计数据并进行计算，其实质是和零点两点成一直线，也就是只使用序号3数据，其线性斜率为0.415，所以使用选项C的范围进行线性与范围验证，更仅仅实际应用，也更接近实际结果。

表1线性试验结果

图2 数据处理图

综上，在进行方法验证，尤其是进行自身对照法的方法验证时，各杂质的范围应为“报告阈值至规定产品标准限度的120%”，自身对照溶液浓度建议使用其他单个杂质的限度浓度，主成分的验证范围推荐使用其LOQ~自身对照溶液浓度的120%，而没有必要做到最大单个杂质限度的120%。这样操作，你验证的方法才是你所使用的方法。

参考文献

[1] ICHQ2(R2):VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES.

[2]中国药典2020年版9101《分析方法验证指导原则》

[3]药品GMP指南：质量控制实验室与物料系统

[4] Pedro Lopez Garcia，Ernesto Buffoni,et al. Analytical Method Validation[J].Wide Spectra of Quality Control，2011.