摘  要

 

在采用高效液相色谱进行分析方法开发时，色谱柱的选择至关重要，色谱柱的键合基质及键合相等对于化合物的分离非常重要，本文对其相关内容进行简述，以期为方法开发色谱柱的选择提供思路。

 

一、背景介绍

 

硅胶填料的生产、制作过程用于谦的《石头吟》“千锤万凿出深山，烈火焚烧若等闲”来形容，恰如其分。从最初的硅酸岩原材料处理成水玻璃，进而通过特殊工艺制成多孔硅胶微粒，最后在硅胶表面进行化学修饰，键合特定的基团，用于化合物的分离。每一道工艺的优化都凝聚了色谱柱相关人员不懈的努力。从80年代的硅胶和有机聚合物的优势结合到21世纪的 “杂化颗粒技术”弥补了硅胶自身的缺陷（如硅醇基残留以及Si-O键在碱性条件下（pH>8）断裂的问题），使之应用更为广泛。

 

近年来，色谱柱研究人员又开发了键合相迵异的色谱填料以增强色谱柱的选择性，如针对极性化合物及其杂质的分析项目而开发的五氟苯基（PFPP）色谱柱、HILIC色谱柱等，针对异构体的分离而开发的二苯基柱等。本文结合自己的工作经验及对色谱柱的一些认识进行了简要的汇总，分键合基质、键合相、色谱柱说明书解析、色谱柱的应用及维护等五个方面进行介绍。

 

 

二、键合基质

 

色谱柱键合基质分为硅胶基质、聚合物基质等，其中硅胶基质应用最为广泛，分为全多孔硅胶微粒、杂化硅胶颗粒和实心核硅胶颗粒。

 

1、全多孔硅胶基质

 

全多孔硅胶，以其全多孔的结构特点具有很高的比表面积，故具有很高的柱效。其机械强度大的特点可保证填充床长时间在很高的操作压力下工作，柱效保持稳定，同时刚性、高强度的微粒还使柱子的反压较低，寿命较长。安捷伦色谱柱硅珠堆砌技术（专利），以ZORBAX为代表，Waters的Sunfire、Atlantis为硅胶基质色谱柱。

 

硅胶基质，作为HPLC色谱柱的担体，并非完美，其特点主要包括以下3方面：

（1）低pH值，硅胶键合键容易水解(pH<2)；高pH值，硅胶容易溶解（pH>8），分别见图1和图2。

（2）在接近中性的条件时，硅醇基裸露，显酸性，不适宜分离碱性化合物。

（3）某些硅胶被一定金属污染，这些金属会引起峰的不对称或拖尾，甚至化合物的死吸附。

图1

 

图2

 

2、杂化硅胶颗粒基质

 

为改善纯硅胶基质的不足，杂化硅胶颗粒应运而生，具有高稳定性、耐受pH及高机械强度的特性，能够改善高pH值条件下硅胶内部水解的问题。Waters公司先后开发了两代无机/有机杂化颗粒技术（HPT与BEH技术）。

 

HPT技术

第一代杂化硅胶合成XTerra®，硅甲基键合，即HPT颗粒杂化技术，使用超纯四乙氧基硅氧烷与甲基三乙氧基硅氧烷作为起始物料合成甲基聚乙氧基硅烷，从而实现在合成基材的同时，对部分硅羟基进行封端。具有较好的机械强度，高球形物态，与高纯硅胶基质相比，可改善碱性分析物的拖尾因子的同时，也提高了对高pH条件的耐受性。

 

合成见图3：

图3

 

BEH技术

 

第二代杂化硅胶合成XBridge®，亚乙基桥键合，即BEH杂化颗粒技术，它是由两种高纯度单体——四乙氧基甲硅烷和双（三乙氧基甲硅烷）乙烷制作而成的颗粒，具有极高的机械强度，比内嵌甲基的第一代HPT技术具有更高的交联度；Si-CH2-CH2-Si的高化学稳定性以及高疏水性，使得BEH杂化颗粒对于高pH条件具有更高的耐受性。见图4：

图4

 

基于上述技术，使键合硅胶基质的pH耐受范围更宽，机械强度更高，柱效佳。安捷伦以StableBond、Eclipse 等代表着杂化硅胶的类型及封端技术。

 

3、实心核硅胶颗粒基质

 

实心核颗粒，即表面多孔实心核颗粒，waters推出了CORTECS分为2.7μm、1.6μm等粒径，与全多孔硅胶比较，由于颗粒密度大、颗粒大小分布窄，传质阻抗、涡流扩散降至最低，从而柱效较高，个人的体验为峰容易过载，多次进样后柱压升高。

 

三、键合相

 

色谱柱键合相的种类很多，如键合型离子交换剂、手性固定相及亲和色谱固定相等，但是最常用的是反相和正相键合相色谱法中的化学键合相，按照所键合基团的极性可将其分为非极性、弱极性和极性三类。本节以非极性键合基团（C18/C8）为例，进行介绍。

 

不同碳链的影响：非极性键合相的烷基链长对溶质的保留、选择性和载样量都有影响。长链烷基可是溶质的K增大，分离选择性改善，使载样量提高，长链烷基键合相的稳定性也更高。

 

不同配体键合：该键合工艺适应于大部分的键合相，C18可分为单键键合、双键键合和三键键合，C18又可分为普通C18和内嵌极性配体等，单键键合的优点为键合密度高，样品载样量大，缺点为疏水性最强，对极性化合物保留不佳；容易发生酸水解键合相流失。

三键键合的优点为酸性条件下键合相稳定性高，其缺点为为键合密度较低，样品载样量小。

带有内嵌极性配体的色谱填料，由于其特殊亲和性及屏蔽效应，使之具有如下性能：1、耐受100%的水相2、使碱性化合物的峰型更完美3、增加亲水化合物的保留，使之具有不同的选择性。

 

不同的含碳量

含碳量越高，固定相传质效应增加，高含碳量，有利于不易保留化合物的分离，水解稳定性好，重现性好；低含碳量，有利于分析有一定保留的化合物，降低溶剂损耗、减少运行时间。

 

粒度大小、形状及孔结构

颗粒度越小，柱效越高（传质好，涡流扩散小），柱压越高（渗透性差）。颗粒的形状分为球型和无定型，其中球型形状柱效高、重现性好，柱床结构均匀；无定型的柱床结构不均匀，流动相线性速度不均匀，谱带扩展。关于硅胶的孔结构，对于小分子（分子量<2000)，通常孔径为80-120Å。120Å代表着多孔硅胶小孔的平均孔径，小分子可轻易扩散进入80-120Å孔径的填料，但较大的多肽和蛋白质则不能，建议用300Å。

 

比表面积

比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加，（梯度洗脱尤为注意）。

 

四、色谱柱说明书举例

 

以Waters的XBridge为例。

解析1：XBridgeShield RP185μm，XBridge为第二代杂化硅胶颗粒（亚乙基桥键合），pH可耐受2-12；shieldRP18为内嵌极性基团C18，可完全兼容100%水相，屏蔽硅醇基，对碱性化合物峰形更佳。

 

 

解析2：由说明书表格内容可知

非键合粒子参数	结果	键合粒子参数	结果
90%/10%粒子直径比	1.64	总碳量	16.61
孔隙容积(cm3/g)	0.76	表面浓度（μmol/m2）	3.25
比表面积(m2/g)	189	Al(ppm)	<1
相比率（m2/cm3）	118	Fe(ppm)	3
平均孔径	146	Na(ppm)	<1

 

粒子直径比，影响柱压；比表面积189（范围160-450）、较低，保留较弱，载样量偏低，平衡时间较短；总碳量为16.61，含碳量较高（范围8-25），保留强，分离度更好，适用于极性化合物的分离；平均孔径为146Å（范围80-120Å），适用于小分子化合物的分离。

 

五、色谱柱的应用(以C18为例)

 

1、对于极性较大化合物的分离

WatersAtlantis T3 在增强极性化合物保留能力的同时，维持了对中等和强疏水性化合物的适度保留能力，100%水相流动相的兼容。

XBridgeShield RP18 极性嵌入基团，增加极性化合物的保留，可兼容100%的水相，由于硅醇基的屏蔽作用，对碱性化合物的峰形更佳。

 

 

XBridge/Atlantis  HILIC 适用于强极性碱性水溶性化合物，可以提供和反相不同的分离选择性。

 

 

ZORBAX StableBond-Aq，专利键合技术，pH可低至1，适用于高酸性流动相，100%纯水相，适用于强极性样品的分离。

 

 

2、对于弱碱性化合物的分离

SunFireC18 色谱柱为超纯硅胶，具有极高的载样量，适合于中低PH流动相条件下化合物的分离与制备，特别是针对碱性化合物，峰型好。

 

ZORBAXEclipse Plus C18，改进的双封端技术(二甲基键合，双封端)，针对碱性化合物而特别研制的色谱柱。 

ZORBAX Extend- C18 专利双齿键合技术，为高pH流动相设计，可用于pH2-11.5，适用于碱性化合物的分离。

 

 

ZorbaxBonus RP 极性酰胺键合相，耐受高水相比例，适用于高水相分离碱性化合物。

 

 

六、色谱柱的维护

 

色谱柱峰形发生改变、压力升高等，意味着色谱柱需要清洗或再生，采用高水相可以清洗系统中的缓冲盐，采用高有机相可以清洗大部分强保留的化合物。若无法解决问题，可根据样品的性质及污染物的性质参照下表选择清洗方法。

备注：四氢呋喃不常用，仪器的管路和密封所用的材料部分为PEEK的，而这种材料对四氢呋喃很敏感，如大浓度或长时间使用，会加快PEEK材料的老化，造成管路与密封失去任性，变硬变脆，很容易损坏仪器。针对出入口筛板孔径一致的色谱柱（绝大多数的5μm粒径色谱柱），也可以尝试0.2ml/min低流速长时间反冲。但对于小于3.5μm小粒径的色谱柱，不建议反冲。

 

[参考文献]

[1] 安捷伦液相色谱柱介绍与选择（培训资料）

[2] Waters-HPLC 色谱柱应用基础_2016

[3] 色谱柱维护与使用指南