摘 要： 建立超高效液相色谱-串联质谱联用及气相色谱-串联质谱联用法测定平贝母中52种禁用农药残留。基于QuEChERS原则的固相萃取法对平贝母样品进行处理，超高效液相色谱-串联质谱联用法采用电喷雾离子源，正离子模式下多反应监测，采用外标法定量；气相色谱-串联质谱联用法采用电子轰击离子源。52种农药的质量浓度在一定范围内与响应值线性关系良好，相关系数均大于0.990，定量限为0.02～0.1 mg/kg。样品平均回收率为75%～120%，测定结果的相对标准偏差为均小于15%。该方法快速、准确检测出平贝母禁用农药残留量，可用用于平贝母质量评价，为平贝母质量安全提供实验依据。

关键词： 液相色谱-串联质谱法； 气相色谱-串联质谱法； 平贝母； 禁用农药残留

 

 

平贝母为百合科植物平贝母的干燥鳞茎，又名坪贝、贝母、平贝[1]，具有清热润肺等功效，与川贝母、浙贝母同属贝母属[2‒3]。主要分布于东北地区的长白山脉和小兴安岭南部地区，主产于黑龙江、吉林、辽宁、山西、陕西、河北等省[4]。

随着国家和社会对安全的重视，未来对中药材农药残留将有更高的要求，国家发布的《中华人民共和国药典》2020年版对中药材禁用农药残留有最新规定和要求[5‒6]。目前对农药残留检测方法有气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法等[7‒10]，具有分离性能高，灵敏度高等特点[11‒12]。吴剑威等[13]用QuEChERS-气相色谱法检测50种中药材农残，刘莹等[14]采用QuEChERS结合GC-MS/MS测定西洋参中17种有机氯残留，该分析方法对中药材的有机氯农药残留测定有进一步研究。王玮等[15]建立QuEChERS-气相色谱-三重四极杆串联质谱法检测西洋参中的多农药残留，适用于西洋参中农药多残留的快速筛查与定量检测。罗京京[16]建立液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法同时测定天麻中53种禁用农药残留。采用色谱-串联质谱法测定平贝母禁用农药残留的方法未有学者检测，笔者采用基于QuEChERS原则的固相萃取法对平贝母样品进行处理，采用气相色谱-串联质谱法和高效液相色谱-串联质谱法结合，对平贝母药材52种禁用农残进行检测，包括甲胺磷、甲基对硫磷、磷铵、六六六、滴滴涕等。该方法具有操作简单、快速、实用性高等优点，健全了平贝母的农药残留检测的限量标准。

 

 

1、 实验部分

 

 

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪：ACQUITY UPLCIclass-Xevo TQ-S micro型，美国沃特世科技有限公司。

气相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪：7000D GC/TQ (HFIE-175)型，美国安捷伦科技有限公司。

电子分析天平：BS124SGC-06型，北京赛多利斯仪器有限公司。

涡旋振荡器：MS3 digital型，德国艾卡公司。

离心机：Sigma3-30k型，赛多利斯(中国)科技有限公司。

32种农药混合标准溶液：批号为20220406-0106，基质编号JZ-07，含有内吸磷-O、灭线磷、杀虫米、治螟磷、甲拌磷、特丁硫磷、内吸磷-S、久效磷、γ-六六六、氟甲腈、β-六六六、δ-六六六、艾氏剂、甲基对硫磷、氟虫腈亚砜、氟虫腈、o，p'-三氯杀螨醇、水胺硫磷、氟虫腈砜、α-硫丹、4，4-滴滴伊、苯线磷、狄氏剂、甲基硫环磷、除草醚、4，4-滴滴滴、α-六六六、p，p'-三氯杀螨醇、对硫磷、硫丹硫酸酯、2，4-滴滴涕、蝇毒磷，各组分质量浓度均为50 μg/mL，中国食品药品检定所。

20种农药混合标准溶液：批号为20220412-0106，基质编号JZ-07，含有涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、硫线磷、克百威、3-羟基克百威、氯磺隆、胺苯磺隆、苯线磷砜、苯线磷亚砜、地虫硫磷、氯唑磷、甲胺磷、甲磺隆、甲拌磷砜、甲拌磷亚砜、硫环磷、磷胺、特丁硫磷砜、特丁硫磷亚砜，各组分质量浓度均为100 μg/mL，中国食品药品检定所。

磷酸三苯酯溶液：0.1 μg/mL，溶剂为乙腈，批号为20211025，上海安谱实验科技股份有限公司。

乙腈：HPLC级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

QuEChERS试剂盒：包括盐包和净化管，厦门精艺兴业有限公司。

平贝母：共30个样本，见表1。

表1   平贝母药材来源信息

Tab. 1   Source information of Fritillaria ussuriensis

 

实验用水为蒸馏水。

1.2 样品处理

取平贝母粉末(过3#筛) 3 g，精密称定，置50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰乙酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，精密加入乙腈15 mL，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡(500 次/min) 5 min，加入QuEChERS盐包，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡(500次/min) 3 min，于冰浴中冷却10 min，以4 000 r/min离心5 min，取上清液9 mL，置于预先装有净化材料的分散固相萃取净化管(无水硫酸镁900 mg，IV-丙基乙二胺300 mg，十八烷基硅烷键合硅胶300 mg，硅胶300 mg，石墨化碳黑90 mg)中，涡旋使充分混匀，置振荡器上剧烈振荡(500 次/min) 5 min使净化完全，以4 000 r/min离心5 min，精密吸取上清液5 mL，置于氮吹仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈稀释至1.0 mL，涡旋混匀，滤过，取续滤液，待测。

1.3 液相色谱-质谱法仪器工作条件

1.3.1 液相色谱仪

色谱柱：ACQUITY UPLC XBrige BEH C18柱[100 mm×2.1 mm，2.5 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为乙腈- 0.1%甲酸溶液(体积比为95∶5)，A、B相均含有5 mmol/L甲酸铵；洗脱方式：梯度淋洗，0～1 min时70% A，1～12 min时70%～0% A，12～14 min时0%～70% A，14～16 min时70% A；流动相流量：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样体积：2 μL。

1.3.2 质谱仪

离子模式：电喷雾电离，正离子扫描；毛细管电压：3.0 kV；干燥器温度：350 ℃；20种农药化合物质谱参数见表2。

表2   20种农药化合物质谱参数

Tab. 2   Mass spectrometry parameters of 20 pesticide compounds

 

 

注：带*的表示定量离子。

 

1.4 气相色谱-质谱法仪器工作条件

1.4.1 气相色谱仪

色谱柱：SH-Rxi-17Sil MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；进样口温度：250 ℃；进样方式：不分流；进样体积：1 μL；柱箱温度：程序升温，初始温度为60 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升温至120 ℃，然后以10 ℃/min的速率升温至160 ℃，再以2 ℃/min的速率升温至230 ℃，最后以15 ℃/min的速率升温至300 ℃，保持6 min；载气：高纯氦气，流量为1.0 mL/min。

1.4.2 质谱仪

电离方式：电子轰击电离模式；电离能量：70 eV；离子源温度：250 ℃；质谱传输接口温度：250 ℃；碰撞气：高纯氮气；四级杆温度：150 ℃；扫描方式：多反应离子监测模式(MRM)，32种农药化合物质谱参数见表3。

表3   32种农药化合物质谱参数

Tab. 3   Mass spectrometry parameters of 32 pesticide compounds

注：带*的表示定量离子。

 

1.5 溶液配制

混合标准储备液：精密量取禁用农药混合标准溶液1 mL，置20 mL容量瓶中，用乙腈稀释至标线，摇匀。

基质匹配系列混合标准工作溶液：取空白基质样品，按1.2.1处理方法处理后，精密量取空白基质溶液1.0 mL (6份)，置氮吹仪上，于40 ℃水浴浓缩至约0.6 mL，分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200 μL，加乙腈稀释至1 mL，涡旋混匀。

磷酸三苯酯溶液：1.0 mg/mL，取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈定容至标线，摇匀。低浓度溶液以乙腈稀释制得。

1.6 定量方法

1.6.1 液相色谱-质谱法

取处理好的样品溶液和基质匹配系列混合标准工作溶液各1 mL，分别精密加入0.3 mL水，混匀，滤过，取续滤液进样测定，记录色谱图，以色谱峰面积标准曲线法定量。

1.6.2 气相色谱-质谱法

取处理好的样品溶液和基质匹配系列混合标准工作溶液各1 mL，分别精密加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液作为内标，混匀，滤过，取续滤液进样测定，以标准曲线内标法定量。

 

2、 结果与分析

 

2.1 质谱条件的优化

2.1.1 液相色谱-质谱法质谱条件

根据各目标化合物分子的化学电离性质，对各化合物的母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数进行优化。选择电喷雾电离正离子扫描和负离子扫描，进行一级全扫描，根据相对分子质量得到母离子离子峰，对其进行二级扫描，在二级谱图中得到碎片离子峰，选择两个信号较强的作为子离子，其中一个作为定量离子，另一个作为辅助定性离子。在MRM模式下，选择基质影响小和丰度值较高作为锥孔电压和碰撞能量。优化后质谱条件见表2。

2.1.2 气相色谱-质谱法质谱条件

选择有代表性的母离子，选取特征离子作为子离子，进行优化定量，优化结果见表3。

混合标准溶液、空白样品和加标样品色谱图见图1。

 

图1   混合标准溶液、空白样品及加标样品总离子流气相色谱图

Fig.1   Total ion flow gas chromatograms of mixed standard solution，blank sample and spiked sample

1—内吸磷-O；2—灭线磷；3—杀虫米；4—治螟磷；5—甲拌磷；6—特丁硫磷；7—内吸磷-S；8—久效磷；9—γ-六六六；10—氟甲腈；11—β-六六六；12—δ-六六六；13—艾氏剂；14—甲基对硫磷；15—氟虫腈亚砜；16—氟虫腈；17—o，p'-三氯杀螨醇；18—水胺硫磷；19—氟虫腈砜；20—α-硫丹；21—4，4滴滴伊；22—苯线磷；23—狄氏剂；24—甲基硫环磷；25—除草醚；26—4，4-滴滴滴；27—α-六六六；28—p，p'-三氯杀螨醇；29—对硫磷；30—硫丹硫酸酯；31—2，4-滴滴涕；32—蝇毒磷

 

2.2 样品处理方法优化

样品处理过程中，首先采用乙腈直接提取法，该方法提取液沉淀多，进样后发现杂质峰较多，对仪器灵敏度及实验结果存在一定影响，同时也说明直接提取法适合基质干扰小的样品。样品通过固体萃取法处理过程中确实能去除杂质，但固体萃取净化过柱耗时过长，对样品的选择性不高。采用基于QuEChERS原则的固相萃取法，处理后能去除杂质，简单快捷，降低样品对于仪器的污染，并获得良好的回收率。

用基于QuEChERS原则的固相萃取法处理样品，以LC-MS/MS法测定时，有约27%的目标物存在基质效应，且基质效应较小；以GC-MS/MS法测定时，有约49%的目标物存在基质效应。综合考虑，选择采用于QuEChERS原则的固相萃取法结合LC-MS/MS法和GC-MS/MS法测定。52种农药基质效应介于-32%～40%，因此，采用空白基质配标抵消基质效应，以提高结果的准确度。

2.3 流动相优化

乙腈和水作为流动相时，色谱峰形和分离度均较差。以0.1%甲酸水+5 mmol/L甲酸铵作为流动相A，以乙腈-0.1%甲酸(含5 mmol/L甲酸铵)作为流动相B，能够得到较好的色谱峰形，同时加入甲酸铵能够提高目标物的响应值。

2.4 线性关系和检出限

在1.4条件下，分别测定基质匹配系列混合标准工作溶液A、B，以各目标物的色谱峰面积对其质量浓度进行线性回归，计算线性方程和相关系数。取基质匹配系列混合标准工作溶液的最低浓度点标准溶液，用乙腈逐级稀释，测定并记录色谱峰面积，以信噪比等于10计算方法定量限。52种农药的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、定量限见表4。由表4可知，52种目标物在一定质量浓度范围内，相关系数均大于0.990，表明线性关系良好，定量限为0.02～0.10 mg/kg，均低于规定的最大残留量，满足农药残留的分析要求。

表4   52种农药质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及定量限

Tab. 4   Linear range，linear equation，correlation coefficient and limit of quantitation of 52 pesticides mass concentration

2.5 加标回收与精密度试验

取空白基质样品，分别添加低、中、高三个浓度水平的32种农药混合标准溶液和20种农药混合标准溶液，平行测定6次，以平均值作为测定值，用基质匹配校准曲线法定量，计算各农残回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表5和表6。由表5可见，32种农药平均回收率为83.8%～114.5%，测定结果的相对标准偏差为0.4%～9.7%(n=6)。由表6可见，20种农药平均回收率70%～125%，测定结果的相对标准偏差为0.6%～5.3%(n=6)。表5和表6结果表明方法回收率和重现性良好，符合禁用农药残留测定要求，适用于平贝母中52种农药残留的同时测定。

表5   32种农药加标回收试验结果 (n=6)

Tab. 5   Results of 32 pesticide spiked recovery experiments (n=6)

表6   20种农药加标回收试验结果 (n=6)

Tab. 6   Results of 20 pesticide spiked recovery experiments (n=6)

 

3、 结语

 

采用基于QuEChERS 原则的固相萃取法对样品进行处理，建立了液相色谱-串联质谱法和气相色谱-串联质谱法同时测定中药材平贝母中52种禁用农药残留。通过选择合适的液相和质谱条件对多组分农药残留进行测定，该法前处理简单，灵敏度高、精密度和准确度好，符合平贝母中多残留分析的要求，能快速实现平贝母中禁用农药化合物的含量分析。实现了对平贝母52种农药残留的检测，为平贝母农药残留调查提供了数据支持。

 

 

参考文献：

 

1 徐朗希，范琳资，姜爽，等.贝母属植物的化学成分和药理作用研究进展［J］.中国药物化学杂志，2022，32（1）：61.

    XU Langxi，FAN Linzi，Jiangshuang，et al. Recent progress of chemical constituents and pharmacological effects of Fritillaria［J］. Chinese Journal of Medicinal Chemistry，2022，32（1）：61.

 

2 王姝婷，杨燕云，许亮，等.平贝母及贝母类药材本草考证［J］.辽宁中医药大学学报，2021，9（23）：149.

    WANG Suting，YANG Yanyun，XU Liang，et al. Textual research on triditional chinese medicine pingbeimu （Fritillariae Ussuriensis Bulbus） and Beimu （Fritillaria） herbal medicine［J］. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，2021，9（23）：14.

 

3 沈莹，孙海峰.平贝母化学成分及药理作用研究进展［J］.化学工程师，2018（6）；62.

    SHEN Ying，SUN Haifeng. Advance in studies on chemical constituents of Fritillaria ussuriensis and their pharmacological effects［J］. Chemical Engineer，2018（6）：62.

 

4 尤宏娟.平贝母种植技术要点［J］.吉林农业，2016（13）：97.

    YOU Hongjuan. Key points of planting technology of Pingbeimu ［J］. Jilin Agriculture，2016（13）：97.

 

5 国家药典委员会.中华人民共和国药典（2020版）：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2020.

    National Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China（2020 Edition）：Part I［M］. Beijing：China Medical Science and Technology Press，2020.

 

6 孙新琪，安芳，鹿倩，等.我国中药材禁用农药残留现状、毒性及分析方法研究进展［J］.中国中药杂志，2022，47（3）：611.

    SUN Xinqi，AN Fang，LU Qian，et al. Residual status，toxicity，and analytical method of banned pesticides in traditional Chinese medicines［J］. China Journal of Chinese Materia Medica，2022，47（3）：611.

 

7 曹殿洁. GC-MS检测中药枸杞中有机磷类农药残留［J］.赤峰学院学报（自然科学版），2013，29（11）：6.

    CAO Dianjie. GC-MS detection of organophosphorus pesticide residues in Chinese wolfberry［J］. Journal of Chifeng University （Natural Science Edition ），2013，29（11）：6.

 

8 王丽娟，孙学丽，于奎峰.气质联用法在食品农残检测中的应用［J］.食品安全导刊，2022（29）：174.

    WANG Lijuan，SUN Xueli，YU Kuifeng. Application of GC-MS in the detection of pesticide residues in food［J］. China Food Safety Magazine，2022（29）：174.

 

9 朱颖洁，曹燕卿，毛劼，等. QuEChERS前处理结合超高效液相色谱-串联质谱法同时检测茶叶中14种农药残留［J］.食品工业科技，2022，43（12）：283.

    ZHU Yingjie，CAO Yanqin，MAO Jie，et al. Determination of 14 pesticide residues in tea by QuEChERS combined with ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Science and Technology of Food Industry，2022，43（12）：283.

 

10 李纯，熊颖，顾利红，等.中药化橘红的106种农药残留量测定研究［J］.中国药学杂志，2019，54（19）：1 604.

    LI Chun，XIONG Ying，Gu Lihong，et al. Determination of 106 pesticide residues in Citrus Grandis Exocarpium［J］. Chinese Pharmaceutical Journal，2019，54（19）：1 604.

 

11 孙瑞卿，秦曙，曹俊丽，等. QuEChERS结合GC-MS/MS及UPLC-MS/MS测定黄花菜中6种农药及其代谢物残留量［J］.农药，2023，62（10）：746.

    SUN Ruiqin，QIN Su，CAO Junli，et al. Residue determination of 6 pesticides and their metabolites in daylily using QuEChERS combined with GC-MS/MS or UPLC-MS/MS［J］. Agrochemicals，2023，62（10）：746.

 

12 张方圆，丁少曼，李欣洁，等.基于QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法测定水果中44种农药残留［J］.食品科技，2023，48（11）：287.

    ZHANG Fangyuan，DING Shaoman，LI Xinjie. et al. Determination of 44 pesticide residues in fruits based on QuEChERS-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］. Food Science and Technology，2023，48（11）：287.

 

13 吴剑威，徐荣，赵润怀，等. QuEChERS-气相色谱法快速检测五十种中药材中九种有机氯农药残留的方法研究［J］.分析科学学报，2011，27（2）：167.

    WU Jianwei，XU Rong，ZHAO Runhuai， et al. Analysis of pesticide residues using the quick easy cheap effective rugged and safe （QuEChERS） pesticide multiresidue method in fifty traditional chinese medicine by gas chromatography［J］. Journal of Analytical Sciences，2011，27（2）：167.

 

14 刘莹，李启艳，胡德福，等. QuEChERS-气相色谱串联质谱法测定西洋参中17种有机氯农药残留［J］.药学研究，2020，39（8）：457.

    LIU Ying，LI Qiyan，HU Defu，et al. Determination of seventeen organochlorine pesticide residues in Panax quinquefolium L. by QuEChERS-GC-MS/MS［J］. Journal of Pharmaceutical Research，2020，39（8）：457.

 

15 王玮，赵莹，郭蓉，等. QuEChERS-三重四极杆-气质联用法测定西洋参中227种农药残留［J］.药物分析杂志，2023，43（11）：1 897.

    WANG Wei，ZHAO Ying，GUO Rong，et al. Determination of 227 pesticide residues in Panacis Quinquefolii Radix by QuEChERS-triple quadrupole-gas chromatography［J］. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2023，43（11）：1 897.

 

16 罗京京，程庆兵，金凤华，等.色谱-串联质谱法测定天麻中53种禁用农药残留［J］.化学分析计量，2023，32（10）：49.

    LUO Jingjing，CHENG Qingbing，JIN Fenghua，et al. Determination of 53 prohibited pesticide residues in Gastrodia elata by chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chemical Analysis and Meterage，2023，32（10）：49.