作者：王玉 杨阳 郑秀娥 崔涛 李国勇 耿友军 夏文龙

单位：山东省食品药品审评查验中心 （山东 济南 250014）

内容提要：文章主要针对按照第二类医疗器械管理的临床化学体外诊断试剂产品，以碱性磷酸酶测定试剂盒为例，从适用范围、性能评估、临床评价等方面，深入探讨产品注册申报过程中的技术审评规范，进一步提高审评审批时效，为企业注册人员和审评人员提供参考和帮助。

关键词：临床化学体外诊断试剂 技术审评 审评规范

体外诊断产业是医疗器械产业的重要分支，是临床医生决定后续治疗方案的科学依据，在疾病的诊疗过程中发挥重要的作用[1]。临床化学体外诊断试剂主要用于血常规、糖代谢、血脂、肝功能、肾功能、心血管疾病、微量元素等物质的检测，是国内起步早、技术成熟、市场格局稳定的细分领域。因该类产品进入门槛和技术壁垒较低，在产品注册申报中仍占较大比重，规范此类产品的技术审评规范，可进一步提升技术审评时效。本文主要依托于本单位承担的国家药品监督局器械技术审评中心指导原则项目，对全国范围内部分从事生化诊断产品研制及生产的企业开展调研，深入探讨此类产品研发及注册申报过程中的常见问题。

1.适用范围

本文所指临床化学体外诊断试剂，是指基于分光光度法原理，体外定量检测临床化学相关检测项目所用的体外诊断试剂，并提供治疗监测、辅助诊断、健康状况评估等信息[2]。

2.分析性能评估

应在产品原材料和生产工艺经过选择和确定的基础上，采用满足质量管理体系要求下生产的产品进行分析性能评估[3]。分析性能评估，应选择预期使用的真实临床样本，采用多批产品进行研究。若申请人声称该产品适用于不同机型，则需要在其声称的所有适用机型上进行性能评估。

2.1 样本稳定性

注册申请人应充分考虑样本采集、处理、运输及保存等过程中的条件，分别进行评价研究。评价内容主要包括建议的保存条件、允许的冻融次数、抗凝剂、防腐剂等。临床检验中，如碱性磷酸酶的检测，血清样本2˚C~8˚C保存可保存4d，-20˚C可保存6 个月，需对不同保存条件及时间的样本进行检测，设计合理的检测时间，确定样本稳定性。对于可冷冻保存的样本，还需研究样本的冻融次数。对于稳定性差、易降解的样本，如血浆样本中的葡萄糖检测，因在室温条件下，易发生糖酵解作用，建议采样后及时检测。

2.2 适用的样本类型

血清、血浆、尿液等是临床化学体外诊断试剂检测常用的样本类型，需对产品样本采集过程中常用的抗凝剂、防腐剂等添加剂进行确认。对碱性磷酸酶的检测，由于乙二胺四乙酸钠盐、草酸盐、柠檬酸盐等对碱性磷酸酶活性有干扰作用，血清、肝素抗凝血浆则是碱性磷酸酶测定的适宜样本。对于同源样本，如血清和血浆，可采用一定数量的血清、血浆同源样本进行对比试验的方法，证明不同样本类型是否可比[3]。如果选择具有代表性的样本类型代替其他可比的样本类型进行分析性能评估，应说明原因并提供证据支持。

2.3 分析灵敏度

采用已知浓度/ 活性的样本，在试剂声称的参数下进行检测，记录产生的吸光度变化。换算为n 单位吸光度差值（ΔA）或吸光度变化（ΔA/min）。建议选择正常参考值附近样本或病理高值样本进行分析灵敏度研究[4]。

2.4 空白限、检出限及定量限

空白限指空白样本（如生理盐水、纯化水等）可能观察到的最高测量值；检出限指仪器能检测的被测物最低浓度，一般由多个独立的低浓度（含被测物）样本的检测结果获得；定量限是指在规定测量条件下，满足申请人声称的正确度及精密度，能测量的样本中可被检测量的最低浓度。申请人应根据产品的具体情况，选择适用的方法进行空白限、检出限、定量限建立及验证。在临床化学体外诊断试剂的前期研发过程中，申请人可根据产品情况和临床试剂应用需求，对产品不适用的情况，应提供充分说明。

2.5 正确度

正确度是评价系统误差的性能特征，通常用偏倚来表示。正确度评价中常见的研究方法包括参考物质检测、方法学比对或回收试验，申请人可选择适合的方法进行研究。

推荐的参考物质包括有证参考物质或国家/ 国际标准品、参考品，具有互换性的正确度控制物质，由参考方法赋值的临床样本等。质控品、产品校准品不可用于正确度评价。若所研究的被测物有国家标准品，如总胆红素、肌酐等，应优先采用国家标准品进行正确度评价。

方法学比对研究中，优先选择参考测量程序或标准方法，其次可选择临床广泛应用、质量普遍认可的已上市同类产品进行比对。应选择可覆盖试剂测量范围的临床样本进行检测，临床样本浓度并尽可能在测量范围内均匀分布。每个样本可一次检测，也可重复多次检测，并评价医学决定水平附近浓度的偏倚。

回收试验是通过在临床样本中加入标准溶液或纯品，配制成回收样本，进行检测。为尽量减小样本基质效应对检测的影响，回收试验中加入溶液的体积一般不超过10%。

2.6 精密度

精密度主要反映随机测量误差，通常用方差、标准差或变异系数来表示。申请人根据产品情况和临床实际应用需求，进行重复性、实验室内精密度、实验室间精密度等的研究。重复性是在测量条件基本不变的情况下产生的变异，为使评估更符合临床应用场景，可采用20×2×2 的试验设计，即检测20d，每天检测2 批，每批重复测量2 次。实验室间精密度研究中应考虑操作人员、设备、环境条件、时间等可变因素的影响。样本浓度应包括测量区间高、中、低至少3 个浓度水平，适用时，应由医学决定水平附近或参考值附近样本的检测点。

2.7 线性区间

线性区间建立时，建议配制出较预期线性区间更宽的9个左右不同浓度的样本（不包括零浓度样本），每个样本检测3 次，计算平均值。根据申请人选择的统计分析方法，计算线性方程、线性相关系数（r）及线性偏差，判断统计结果是否满足可接受标准。对线性区间的验证，可采用接近线性区间的高值、低值样本按比例稀释获得至少5 个稀释浓度，每一浓度至少测定2 次，计算检测结果的均值，求出线性方程。

超出线性区间浓度的样本，如可稀释后进行检测，申请人需要研究适用的稀释液和稀释倍数，并确定试剂的可报告区间。

2.8 校准品的量值溯源和质控品的赋值（如适用）

临床化学体外诊断试剂若包含校准品、质控品，应提供校准品量值溯源资料和质控品赋值资料。校准品量值溯源资料应明确校准品溯源链、详细说明校准品的溯源顶端选择的有证参考物质或参考测量程序，溯源链的逐级传递过程、校准品不确定度、产品校准品互换性资料等。质控品赋值资料应提供质控品在不同适用机型上赋值及验证的资料。若校准品/ 质控品的基质与产品预期适用的临床真实样本不一致，应进行基质效应的相关研究。

2.9 干扰物质研究

研究者应对与待测样本具有潜在干扰作用的物质进行研究，并结合临床实际需求选择适用的干扰物质进行评价，并提供相关资料。干扰物质评价的方法可采用添加干扰物的方式进行，也可使用临床样本进行评价。常见的内源性干扰物质包括血红蛋白、甘油三酯、胆红素、胆固醇、类风湿因子、抗坏血酸等；常见的外源性干扰物质包括样本添加剂（如抗凝剂、防腐剂等）、患者服用的药物、食物及其代谢物等，同时应充分考虑文献报道中的关于类似试剂或测量程序中存在的干扰物质。

3.稳定性

应包括研究方案、研究报告和研究数据。稳定性研究包括实时稳定性、开封稳定性和运输稳定性等。试剂稳定性研究应考虑可能影响试剂性能或效果的因素，考虑环境因素的变化，充分验证在最不利条件下的产品稳定性。

实时稳定性也称货架稳定性，在制造商声称的储存条件下，保存至失效期的时间内，评估体外诊断试剂的各项性能特性。需要选择至少3批申报试剂开展稳定性研究。申请人应根据实际情况设定合适的检验试验间隔，若产品有效期为1 年，可选择每隔3~4个月进行检验。

使用稳定性应对试剂所包含的所有组分的开封稳定性进行评估，应至少提交一批申报产品的开封稳定性研究资料。若试剂中包含冻干粉，应提供复溶稳定性研究资料。若试剂可冷冻保存且可多次使用，需提供试剂冻融次数的研究资料。如试剂中包含校准品，还应提供校准稳定性或校准频率的研究资料。明确试剂在使用过程中需满足的环境条件。碱性磷酸酶的测定，在碱性条件下进行，开封试剂可能因吸收空气中的二氧化碳而使pH降低，影响测定结果，应注意开封试剂的使用时间，采用合适的校准计划。

运输稳定性主要评估体外诊断试剂运输过程中环境条件的变化对其实时稳定性及使用稳定性的影响。需要选择至少1 批申报试剂进行运输稳定性，并提交相应的研究资料，应充分考虑试剂运输过程中可能遭遇的各种条件，如高温、低温、反复冻融、湿度、堆放、跌落、振动等影响因素。运输稳定性可结合实时稳定性研究开展，即将运输后的试剂按照企业声称保存条件，保存至有效期末，根据设定的时间间隔进行评估，以确定试剂稳定性是否受到运输条件的影响。

4.参考区间

参考区间是产品的重要属性，是被测物在正常人群中的测量值范围。参考区间相关研究应在产品完成前期研发且产品定型以后完成。申请人可以选择建立或验证的方式确定申报产品的参考区间。参考区间的建立一般包括如下过程：参考人群的选择、样本量计算与确定、样本检测、检测结果的统计分析、计算参考限值、得出参考区间[5]。参考区间研究过程中，申请人应根据检测结果的分布情况（正态分布或偏态分布），选择合理的统计学方法建立参考区间[5]。临床化学检测项目为常规检测项目，应在满足相关法规及指导原则相关要求的情况下，引用临床诊疗共识、诊疗指南等普遍认可的参考区间，采用验证的方法确定试剂的参考区间。通过此种方法确定的参考区间既可保证检验结果的权威性，也可实现不同检验实验室间的检验结果互认，但申请人应进行充分的验证[6]。

无论是建立或验证参考区间，都要保证参考区间的可溯源性。记录参考区间研究过程中的所有步骤，如参考个体选择、分析前因素、样本检测、统计分析方法等。由于参考区间研究中受所选人群受地域、人种等因素的限制，因此在临床应用中，建议各临床实验室建立自己的参考范围。

5.临床评价

临床评价包括临床评价和临床试验两种评价途径[7]。对生产工艺成熟、技术原理明确，且属于列入《免于临床试验体外诊断试剂目录》的项目，可开展免于进行临床试验的临床评价，相关资料应符合《免于临床试验的体外诊断试剂临床评价技术指导原则》的相关要求。对于未列入《免于临床试验体外诊断试剂目录》、涉及自测的产品，申请人应进行临床试验，试验过程应符合《医疗器械临床试验质量管理规范》的相关要求、试验设计、数据统计分析等应符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求。

5.1 受试人群及样本要求

临床评价应选择纳入预期用途声称的适用人群样本，同时考虑干扰因素，样本浓度覆盖试剂测量区间，并注意各浓度水平均应包含一定数量的样本。尽量覆盖各类适用人群，如性别、年龄等。例如，对血糖检测建议纳入不同年龄、不同糖尿病类型的人群。入组样本数量方面应满足统计学要求，一般不少于100 例。

临床评价中应采用真实临床样本。如碱性磷酸酶测定试剂盒进行临床评价，若临床血清样本无法覆盖其测量区间，应在充分说明无法获得的依据的情况下，可采用人工制备样本。人工制备样本可以是稀释或者处理去除碱性磷酸酶获得的低浓度样本、或添加碱性磷酸酶获得的高浓度样本，需要注意人工制备样本不可超出总样本量的20%，稀释或添加过程中要考虑基质效应。

5.2 方法学比对

临床化学体外诊断试剂多为常规检测项目，在临床广泛应用，已有较多产品上市，采用同品种方法学比对是较为经济合理的研究方法。对比试剂应选择已获批准上市的、与待评价试剂具有相同预期用途的产品。此外，申请人需提供对比试剂和待评价试剂的基本原理、性能指标、参考区间等内容的比对分析，并说明可能存在的差异对临床样本性能检测的影响。

5.3 统计学分析

收集临床样本的检测数据后，首先绘制散点图和差异图，对数据进行分析，通过散点图和差异图，来观察检测数据是否覆盖了被测物检测范围，是否存在离群值等。根据散点图和差异图判断数据满足的假设前提，选择确定最佳的回归分析方法，评估待评价试剂和对比试剂的检测结果的一致性，并对评价指标进行假设检验。

6.产品技术要求及检验报告

6.1 主要性能指标

临床化学体外诊断试剂产品作为定量检测试剂，应包含以下性能指标：试剂外观、装量、空白吸光度、准确度、精密度、分析灵敏度、线性区间等。如产品包含校准品和质控品，可设定下列性能指标：校准品性状、正确度、均匀性等，质控品外观性状、预期结果、均匀性等。产品技术要求的制定可参照相应的行业标准的要求，具体性能指标需结合产品方法学特性。

6.2 检验方法

申请人需根据产品的具体特征、性能指标等设定产品的检验方法，推荐优先选择已建立的、广为接受的标准检验方法；也可采用申请人自建的检验方法。检验方法应有可操作性、可重复性，需明确检验过程中的试验步骤、检测次数、检测结果的计算方法和表示方式等，此外还需明确检测过程中所用样本的制备方法。

6.3 产品检验报告

检验用产品应在原材料和工艺稳定可靠的基础上，在符合医疗器械质量管理体系相关要求的条件下生产。产品适用于国家标准品的，应当使用国家标准品对产品检验。申请人可提交满足相关要求的自检报告，也可提交委托有资质的医疗器械检验机构出具的检验报告。

7.说明书

说明书作为体外诊断试剂产品注册证附件，是注册申报中最重要的资料之一。说明书中载明了关于产品检验方法、检测样本要求、产品储存条件预期使用人群、产品技术原理、产品性能指标等重要信息，用于指导检验人员正确使用产品。说明书中的储存条件及有效期、样本要求、参考区间、干扰物质、性能指标等数据相关信息，应提供相应支持性资料，并与研究结果保持一致。说明书编写过程中应注意如下问题：①明确试剂各组分的含量或浓度，对于包含多组分的试剂盒应说明不同批次试剂盒中各组成成分是否可以互换。②对于产品中的非试剂组分应明确其此相关信息，如部分临床化学体外诊断试剂盒中不含校准品、质控品，应明确推荐使用的校准品、质控品信息。③明确样本是否可稀释后测定，若可稀释，需说明稀释液成分及最大可稀释比例。④性能指标应概况总结分析性能评估及临床评价的内容，并与申报资料的研究结果保持一致。

8.小结

临床化学体外诊断试剂技术趋于成熟，市场发展稳定，试剂国产化率高，提高产品质量，创新研发新产品，是该类产品的主要发展方向。在技术审评中，应充分考虑产品的技术原理，分析性能研究内容、校准品量值溯源、参考区间确定、以及临床评价的检测数据结论，结合已发布的行业标准、指导原则等进行综合评估，对申请人提交的说明书、技术要求、临床评价资料等予以充分重视及关注，提升产品质量，降低潜在风险。