新药申报时，药品质量标准中分析方法必须验证；药物生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，质量标准分析方法必须进行验证。

一、分析方法学验证事项

药物分析检验时药品生产的GMP的药物分析的方法学验证，是保证药物分析结果准确性的前提和基础，也是实现药物分析检测GMP的必然要素。构成药物分析中的检测方法验证，涉及以下方面的内容：

1、分析方法验证成功的前提条件：

（1）仪器已经确认、校正并在有效期内 

（2）经过培训的人员

（3）可靠稳定的对照品

（4）可靠稳定的实验试剂

（5）确认受试溶液的稳定性，在规定时间内无降解

2、分析方法学验证所要求验证的内容：

（1）含量的测定 

（2）杂质的含量测定 

（3）药物的定性鉴定 

（4）药物的含量均匀度测定 

（5）药物的微生物检测 

（6）药物的细菌内毒素的检测

验证内容

准确度：

准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。

测定回收率R（recovery）的具体方法可采用加样回收试验法来进行测定。加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。

数据要求：规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次

精密度：

（重复性、中间精密度和重现性精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。

（1）重复性(repeatability)：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品各测三次或把被测物浓度当作100%，至少测6次进行评价

（2）中间精密度：同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度

（3）重现性(reproducibility)：不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度

（4）数据要求：需报告SD，RSD和可信限

专属性： 

指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量

• 通常通过分析含有加了杂质、降解产物、有关化学物质或安慰剂成分的样品，将所获分析结果与未加前述成分之样品的测试结果进行比较，两组测试结果之差即专属性

•鉴别反应---应能与可能共存的物质或结构相似化合物区别，不含被分析的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应

•含量测定和杂质测定---色谱法和其他方法，应附代表性图谱，亦说明专属性；图中应标明各组份的位置，色谱法中的分离度应符合要求

•杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测试结果是否受干扰；对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质间是否得到分离

检测限： 

检测限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量；它是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可

•非仪器分析目视法：用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量

•信噪比法：用于能显示基线噪音的分析方法（仪器分析方法），是把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量；一般以信噪比3∶1或2∶1时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限

•也可采用标准差法：

空白值＝0时；

①测定背景10次以上，求出标准差σ；

②将σ乘以三倍；

③在工作曲线上求出3σ相对应的浓度X，即为方法的检出值。

空白值不等于0时；

①测定背景10次以上，求出标准差σ；

②将σ乘以三倍；

③在工作曲线上求出3σ相对应的浓度X；

④将求得的对应浓度值加上空白值即得该方法的检出限。

定量限（limit ofquantitation LOQ）

•指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求

•常用信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为10∶1时相应的浓度或注入仪器的量进行确定，也可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限

线性：

在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（Slope）来表示。数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数、y截距（是检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参数，应列出回归方程数和线性图。

注意：做线性时，应注意尽量做的点多一点、线性浓度范围宽一点，这样做的好处是：当你在准确度考察时，你做的回收率考察的浓度就大些，配制溶液时就容易操作些；否则，在你做线性考察时，你做的线性浓度范围不宽，那么你在考察回收率时，你采用加入法考察时的浓度变化范围就不宽，操作浓度很难控制，造成实际操作困难。

范围：

指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。

•原料药和制剂含量测定范围为80%-120%；制剂含量均匀度范围为70%-130%；杂质测定应为被测杂质汇报值到限度的120%；溶出度应为测定范围的±20%，如规定了限度范围，应为下限的-20%至上限的+20%，例如缓释片1h<20%，7h>70%,则验证范围定为0-90%。

耐用性：

指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度；如果方法易受到分析条件的影响，或要求苛刻，应注明。

典型的变动包括：分析溶液的稳定性，提取时间等。

二、药物分析的方法学验证事项

含量测定方法验证的接收标准

*容量分析法：用原料药精制品(含量>99.5％)或对照品考察方法的精密度，相对标准差一般应不大于0.2％；进行回收率试验。回收率一般在99.7～100.3％之间。

*UV法：用适当浓度的精制品进行测定，其RSD一般不大于1％。制剂的测定，回收率一般应在98％～102％之间；线性：吸光度A一般在0.2～0.7，浓度点n＝5。用浓度c对A作线性回归处理，得一直线方程，r应达到0.9999(n＝5)，方程的截距应近于零含量测定方法验证的接收标准。

*HPLC法：

*要求RSD<2％，回收率98％～102％之间。

*线性范围：用精制品配制一系列标准溶液，浓度点n应为5～7，用浓度c对峰高h或被测物的响应值之比进行回归处理，建立回归方程，r应大于0.999，截距应趋于零。

分析方法验证步骤

*验证方案的制订

*验证目的、方法改进背景、

*提供的原料药和产品、仪器概要、试剂、对照品

*待验证的方法，项目，合格标准

*实施人员的培训

*参考文献

*验证的实施

*收集完整的验证过程记录和原始图谱

*复核

*验证报告

*评价该方法是否通过验证

方法确认和方法转移

*对新产品的方法验证通常在产品开发阶段完成；大规模生产后的验证通常包括方法确认和方法转移

*分析方法确认是指当国家标准或药典标准拟变化或已经变化时在本实验室进行的对所涉及产品是否适用的确认实验

*确认之前应对新旧方法进行核对，标明所有变更细节

*检验样品的信息（批号、规格)，变更项目的接收标准

*确认试验的样品通常包括正常产品、稳定性产品

*方法转移指检验方法由转移方转移至接收方时进行的实验

*流动相PH（±0.5)

*流动相组成(有机相±5%）

*色谱柱（同一厂家的三个批号，或两个不同厂家（同固定相和填充物，尺寸）

*温度（20-25C)和流速(±10%）

*检测波长(±5nm)

检验项目和验证内容总结

*鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求

*杂质的限度检查除专属性、检测限、耐用性外，其它都不要求

*杂质的定量测定除检测限外，其它都要求

*含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求