中枢神经系统感染病原体宏基因组测序试剂是指对来源于脑脊液等人体样本中的中枢神经系统感染病原体的DNA进行体外定性检测的试剂，预期用途为中枢神经系统感染的辅助诊断。该类产品在临床中的应用日趋广泛，有关专家共识也于近年陆续发布。相关产品的研发和申报也成为目前业界的热点之一。

本研究根据笔者的工作实践，介绍了对中枢神经系统感染病原体宏基因组测序试剂质量评价的关注点以及涉及检测的病原体范围、企业参考品的设置、反应体系的研究以及分析性能评估的主要内容。旨在通过梳理企业在产品研发过程中面临的共性问题，助力相关产品的临床应用。

１、 反应原理

中枢神经系统感染是由于病原体侵犯脑和脊髓的实质、被膜及血管引发的炎性或非炎性疾病。中枢神经系统感染病原体包括病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体以及寄生虫等。用于检测中枢神经系统感染病原体的常用分子生物学检测技术有封闭巢式多重PCR熔解曲线法、可逆末端终止测序法以及联合探针锚定聚合测序法等。

中枢神经系统感染病原体宏基因组测序试剂的反应原理基于高通量测序技术，首先从患者的脑脊液样本中提取核酸，构建DNA测序文库，然后上机测序，获得序列信息。最后通过结果分析软件对测序数据进行分析，判断疑似患者是否感染以及感染何种病原体。宏基因组测序理论上可以对不明病因的中枢神经系统感染的全部潜在病原体进行检测。该类产品可与常规生物化学检查、病原体培养或传统PCR检测方法联合使用，为疑难危急重症以及罕见病原体感染的诊断提供了有效手段。目前的技术路线可分为检测病原体游离（cell-free）DNA和全细胞（whole cell）DNA两大类[1-4]。

2、 检测的病原体范围

宏基因组方法可以无靶向地检测样本中的病原体。为充分验证该类产品对病原体的检测能力，需要确定有充分代表性的病原体检测范围，具体为中枢神经系统感染的常见致病菌及具有较大临床需求的其他致病菌（如使用其他检测手段容易漏检的致病菌等）。

代表性病原体确定的主要原则包括：①具有临床使用价值，在临床广泛应用、备受临床关注的病原体；②具有系统生物学的代表性，覆盖病毒、细菌、真菌和寄生虫等主要系统大类；③具有技术验证的代表性，技术层面较难检测的病原体；④具有可及性，在临床上发生频率相对较高。

鉴于宏基因组方法对于RNA检测的灵敏度较低，应用尚不成熟，因此，本研究仅讨论宏基因组方法用于DNA检测的内容。

3、 企业参考品的设置

企业应在保证产品原材料和生产工艺稳定可靠的基础上，科学合理地设置企业参考品，并相应地进行产品性能验证以及后续的产品检验。

企业参考品中病原体的种类及浓度量值，应满足临床使用需求。其中阳性参考品、检测限参考品应包括声称可检出的病原体主要亚型，阳性参考品应设置不同浓度。阴性参考品应根据最终确定的靶标病原体补充可能产生交叉反应的其他病原体以及干扰样本。重复性参考品至少包括弱阳性水平。如果涉及将病原体DNA提取后打断制备企业参考品，还应对打断后核酸片段的长度进行研究，以证明可以充分模拟真实样本中的病原体游离DNA。另外，明确企业参考品的人源核酸背景基质，如为模拟基质，须说明制备方法和组成情况，并提交能够充分模拟真实样本的证据。

4、 反应体系的研究

4.1 样本处理方法的研究

对于每类病原体，分别评价并比较物理研磨、化学裂解、酶消化等样本前处理方法对于产品性能的影响，以保证产品能够实现检测厚壁的真菌以及胞内寄生菌。另外分别评价并比较不同的去除宿主基因组的方法、是否破除细胞壁、柱提取或者磁珠提取方法、超声/酶/转座酶等核酸片段化方法对于产品性能的影响。

研发人员需对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒等微生物的核酸提取性能验证，避免漏检。不同的核酸提取试剂也需要验证包括核酸提取效率，提取后核酸浓度、纯度、完整性，精密度和抗干扰能力等研究及功能性试验。

4.2 湿试验检测流程的研究

开展对临床样本用量、试剂用量、反应条件（包括测序读长以及单双侧、测序深度及检测数据量等）的研究。明确文库质控要求及检测方法，产品检测结果的质量控制指标应不低于相关行业共识的要求，例如建议有效测序数据量不低于20M，对于检出序列数测序读长50bp以上等。由于不同类型的病原体基因组大小以及核酸提取效率存在差异，故应分类解读结果。例如显著区分于人基因组的病毒阈值为3/100万以上考虑可信，真菌阈值为5/100万以上考虑可信，胞内菌阈值为1/100万以上考虑可信，寄生虫阈值则为10/100万以上考虑可信。原始试验数据包括文库制备起始量、标签接头、pre-PCR文库编号、混合文库编号、混合文库浓度、post-PCR文库浓度、下机总数据量、Q20%、Q30%、平均深度、检出病原体序列数、病原体基因组覆盖率、病原体相对丰度、病原体绝对丰度、特异性测序读长、文库片段分布。同时应开展样本去宿主细胞或核酸的方法建立的研究。如适用，还须提供背景病原微生物扣除的信息。另外试剂盒中应合理设置内参以及阴阳性对照[5]。

5、分析性能评估

应在主要原材料和反应体系经过确认、生产工艺得到有效控制且保证产品质量稳定的基础上，制订方案并开展相应的研究。试验人员应经过必要的培训，熟悉检测系统的操作程序和试验方案，严格执行质量控制。在对结果进行数据检查后，选择适当的统计方法进行分析，并形成研究报告。以下阐述了该类试剂主要性能的评价内容，包括样本类型以及研究方法等。对于性能评估用的所有样本，均应采用性能可靠的方法对含有病原体的种类进行确认，包括但不限于已上市的PCR检测试剂、测序、数字PCR、G试验、GM试验、病原体特异性抗体或抗原的血清学试验等[6-7]。

5.1 最低检测限

每种病原体均应通过对含有已知浓度的1~5个菌株、毒株或血清型的系列稀释样本进行检测，用来确定申报试剂的检出限。然后可通过对含有检出限浓度病原体的样本进行20次重复检测来验证检出限。对于细菌和真菌，检出限以CFU或细胞数表示；病毒以感染单位（如CFU）表示。同时明确宿主细胞或宿主DNA浓度，对不同浓度宿主含量条件下的最低检出限进行研究，须考虑临床可见最高浓度宿主细胞或者宿主来源的DNA作为基质成分对不同浓度病原体核酸进行检出限的确定和验证。

5.2 包容性

选择能够代表检测病原体包容性的病原体菌株、毒株或血清型的样本等进行检测，所选样本能够代表病原体相关的种属、亚种或血清型，每种病原体应包含5~10个样本。应在检出限浓度水平进行检出限验证，并在1.5~3倍检出限的水平进行重复性验证。另外对本产品可以检测却无法进行实验测试的罕见病原体进行生物信息学分析以预测其反应性。

5.3 分析特异性

分析特异性包括交叉反应、干扰试验和竞争性抑制研究等。交叉反应建议以生物信息学分析为补充，确定潜在的交叉反应性序列或微生物。例如，生物信息学分析表明，流感嗜血杆菌检测可能与溶血嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌和唾液嗜血杆菌发生交叉反应；肠道病毒检测可能与鼻病毒发生交叉反应；新型隐球菌可能与淀粉隐球菌发生交叉反应。应通过试验确认上述生物信息学分析所预测的病原体的交叉反应性。交叉反应研究病原体浓度要求细菌为≥1.0×106CFU/mL，病毒为≥1.0×104U/mL，真菌和原生生物为≥1.0×105 U/mL；种类可参考以下情况：脑脊液中的脑膜炎/脑炎非靶标病原体，包括境内常见以及不常见的微生物；可能存在脑脊液中的，可能不会导致脑膜炎/脑炎的非靶标病原体，包括院内感染的微生物、与免疫功能不全相关的微生物，污染或共生微生物，从其他感染部位播散至脑脊液的微生物；与靶标病原体相邻种系的微生物，包括相同种属不同类型的微生物；相同的属或科，人类共生或者可能存在于脑脊液中的微生物；相同的属或科，不存在于脑脊液中的微生物；不同属但密切相关的微生物。通过生物信息学识别交叉反应风险，包括人类共生微生物并罕有脑膜炎/脑炎报道，无临床相关性的微生物。

干扰试验应对代表性病原体分别在其2~3倍最低检测限（limit of detection, LOD）水平进行干扰研究。须评估脑脊液样本中可能存在的或在样本采集和检测时可能引入的潜在干扰物质对产品检测性能的影响，包括乳酸、白细胞、免疫球蛋白、人全血和人类基因组DNA等内源性物质和转运培养基、消毒剂等，并提供干扰物质浓度选择依据。外源性药物包括针对中枢神经系统感染常用抗病毒药物、抗真菌药物及抗生素。竞争性抑制为评估潜在竞争性或干扰性病毒及其他微生物对产品检测结果的影响。需在每种病原体2~3倍LOD水平，对高浓度的可检出的其他病毒、细菌或真菌进行竞争性抑制研究。如适用，还需进行携带和交叉污染的研究。

5.4 精密度

应考虑不同研究地点、日内/日间、操作者间、产品批次间以及不同仪器间带来的潜在变异，采用涵盖全部代表性病原体的菌株、毒株或血清型的不同排列组合的样本进行精密度研究，样本需包含阴性、弱阳性（1.5~3倍LOD）和中等阳性浓度水平。另外建议采用ANOVA方法，对总精密度的不同变异分量进行统计分析。

6、总结与展望

目前宏基因组测序技术在中枢神经系统感染病原体核酸检测方面的应用逐渐广泛，针对产品设计开发过程中存在的技术难点以及规范性问题，本研究结合定性检测体外诊断试剂分析性能评估技术指南文件、相关专家共识等，就产品性能评估的研究内容以及质量控制的关键要素进行了初步探讨。希望能够帮助相关企业大幅提高产品研发的效率，从而加速高质量的产品上市，真正使得医生和患者受益。

参考文献

[1] 《中华传染病杂志》编辑委员会. 中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识[J]. 中华传染病杂志, 2020, 38(11): 681-689.

[2] 中华医学会检验医学分会. 高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识[J]. 中华检验医学杂志, 2020, 43(12): 1181-1195.

[3] CHIU C Y, MILLER S A. Clinical metagenomics[J]. NatRev Genet, 2019, 20(6): 341-355.

[4] MILLER S,  NACCACHE S N,  SAMAYOA E, et al.Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencingassay for pathogen detection in cerebrospinal fluid[J].Genome Res, 2019, 29(5): 831-842.

[5] 宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用共识专家组, 中国研究型医院学会脓毒症与休克专业委员会,中国微生物学会微生物毒素专业委员会, 等. 基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)[J]. 中华危重病急救医学, 2020, 32(5): 531-536.

[6] 国家药品监督管理局. 关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告(2021年第122号)[EB/OL].  (2021-09-29)  [2023-09-01]. https://www.nmpa.gov.cn/ylqx/ylqxggtg/20210930161420143.html.

[7] 国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心. 定性检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则(2022年第36号)[EB/OL]. (2022-09-28)[2023-09-01]. https://www.cmde.org.cn//flfg/zdyz/zdyzwbk/20221008110559100.html.

【文章来源】中国医疗器械杂志 监管与测试 2024年第48卷第3期