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高效液相色谱法测定坦西莫司的含量及有关物质

嘉峪检测网        2024-08-22 20:46

摘 要: 建立高效液相色谱法测定坦西莫司的含量及有关物质。使用ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.2%(体积分数)磷酸为流动相进行梯度洗脱,流量为1.0 mL/min,检测波长为280 nm,柱温为45 ℃,进样量为20 µL。结果表明,坦西莫司的质量浓度在5.03~251.5 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好,相关系数为0.999 9,检出限、定量限分别为0.012、0.040 μg/mL。样品的平均回收率为100.40%,测定结果的相对标准偏差为0.64%(n=9)。坦西莫司破坏试验产生的杂质峰能达到良好的检测与分离。该方法专属性强、准确度高、灵敏度好,可用于坦西莫司含量及有关物质的测定。

 

关键词: 坦西莫司; 有关物质; 含量测定; 高效液相色谱法

 

 

坦西莫司是由美国惠氏制药公司研制,于2007年5月经美国FDA批准上市的药物,主要用于晚期肾细胞癌的治疗[1‒2],也是能够显著延长肾癌患者生存期的药物。最近的研究结果表明,坦西莫司对多种肿瘤细胞具有较好的抗肿瘤活性,包括子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌等[3]。坦西莫司是西罗莫司(雷帕霉素)C42位丙酸酯类衍生物,是西罗莫司靶蛋白(mTOR)的特异性抑制剂[4‒5]。其作用机制是与胞浆蛋白FKBP-12结合并形成复合物,从而抑制mTOR激酶,阻断多条细胞信号传导通路,导致细胞周期在G1到S阶段停滞,抑制细胞生长和增殖,同时降低血管生长因子的水平,阻止肿瘤新生血管的发展,从而发挥抗肿瘤作用[6‒7]。与西罗莫司相比,坦西莫司的亲水性更强,在相同浓度下的抗肿瘤活性也更强[8‒9],而且药物的不良反应较小[10]。

坦西莫司中杂质的含量直接关系到临床治疗的疗效及安全性,为保证其质量安全可靠,有必要制定更为合理的检测方法来控制坦西莫司中的有关物质。高效液相色谱法用于检测西罗莫司有关物质及含量的方法多有报道[11‒13],但高效液相色谱法检测血浆中坦西莫司蛋白结合率偶有报道[14‒15]。笔者建立了测定坦西莫司含量及有关物质的高效液相色谱方法,该方法专属性强、灵敏度高、简便快捷,能够对坦西莫司中的杂质以及生产、贮存过程中降解产物等进行有效控制。

 

 

1、 实验部分

 

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪:LC-20AT型,二极管阵列检测器,日本岛津公司。

数控超声波清洗仪:KQ-50E型,江苏昆山市超声仪器有限公司。

紫外分光光度计:UV-2450 PC型,日本岛津公司。

电子天平:NewClassic MS105DU型,感量为0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

光照稳定性试验箱:TE-500LA型,上海康励仪器设备有限公司。

坦西莫司对照品:批号为J02H182905,含量99.80%,上海源叶生物科技有限公司。

坦西莫司样品:批号为20221108、20230215、20230320,吉林省药物研究院。

坦西莫司粗品:批号为20221101,吉林省药物研究院。

乙腈:色谱纯,赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

磷酸:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱:ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美国安捷伦科技有限公司);流动相:A相为乙腈,B相为0.2%(体积分数,下同)磷酸溶液,流量为1.0 mL/min;检测波长:280 nm;柱温:45 ℃;进样体积:20 μL;洗脱方式:梯度洗脱,洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Condition of mobile phase in gradient elution

 

 

1.3 溶液制备

粗品溶液:精密称取坦西莫司粗品12.5 mg,置于25 mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀释至标线,摇匀滤过,作为样品粗品溶液。

样品溶液:精密称取坦西莫司样品12.5 mg,置于25 mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀释至标线,摇匀滤过,作为有关物质样品溶液。

对照溶液:精密量取上述样品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中,加入乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为有关物质对照溶液。

含量测定溶液:精密量取上述样品溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,加入乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为含量测定溶液。

对照品溶液:精密称取坦西莫司对照品12.5 mg,置于25 mL容量瓶中,加乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为对照品储备液。精密量取上述溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,加乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为对照品溶液。

空白溶剂:取乙腈溶液作为空白溶剂。

光照破坏溶液:称取样品5.0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入乙腈溶解并稀释至标线,置于光照箱内照射8 h,摇匀滤过,作为光照破坏溶液。

高温破坏溶液:称取样品5.0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入少量乙腈溶解后滴加适量水,于80 ℃水浴加热6 h,取出放冷,加入乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为高温破坏溶液。

碱破坏溶液:称取样品5.0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入少量乙腈溶解后,加入0.1mol/L氢氧化钠1 mL,室温放置5 min,然后用0.1 mol/L盐酸调pH为中性,加入乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为碱破坏溶液。

氧化破坏溶液:称取样品5.0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入少量乙腈溶解后,加入30%过氧化氢1 mL,室温放置24 h,然后加入乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为氧化破坏溶液。

酸破坏溶液:称取样品5.0 mg,置于10 mL容量瓶中,加入少量乙腈溶解后,加入1 mol/L盐酸1 mL,常温放置1 h,然后用1 mol/L氢氧化钠调pH为中性,加入乙腈稀释至标线,摇匀滤过,作为酸破坏溶液。

1.4 实验步骤

取对照品溶液及含量测定溶液,在1.2仪器工作条件下进样分析,记录色谱图峰面积,按外标法计算样品的含量。取样品溶液及样品对照溶液,在1.2色谱条件下进样分析,记录3倍坦西莫司峰保留时间下的色谱图,按主成分自身对照法计算杂质含量。

 

 

2、 结果与讨论

 

 

2.1 检测波长的选择

精密吸取坦西莫司对照品溶液适量,加入乙腈稀释,配制成10 μg/mL的溶液,按照紫外-可见分光光度法在200~400 nm波长处扫描,结果表明在280 nm波长处有最大吸收。在破坏性试验中,大多数降解产物均在280 nm波长处有较强的紫外吸收,主成分坦西莫司在280 nm波长处也有吸收,因此检测波长均选定为280 nm。

2.2 流动相的选择

有关物质条件摸索时选择不同配比的乙腈和水做流动相,发现主峰峰形不好、拖尾严重,与相邻的杂质峰分离度小于1.5。因该化合物为弱酸性,若在流动相中加入少量酸如磷酸溶液,可以消除峰拖尾现象,因此选用乙腈与不同浓度的磷酸作流动相。以乙腈与0.1%磷酸作为流动相时,主峰峰形较好,但是与相邻的杂质峰分离度小于1.5;以乙腈与0.2%磷酸作为流动相,初始体积比为65:35,进行梯度洗脱,主峰保留时间约为16 min,与相邻的杂质峰分离度大于1.5,所有色谱峰能达到基本分离,最终选择乙腈-0.2%磷酸作为流动相。

2.3 柱温的选择

考察柱温35、40、45、50 ℃时,坦西莫司主成分色谱保留时间、理论塔板数以及主峰与相邻杂质峰的分离度。结果表明,随着柱温升高,主峰出峰时间略有提前,主峰与相邻杂质峰的分离度有增加趋势。45 ℃和50 ℃没有显著区别,考虑到较低的柱温更适用于延长色谱柱的寿命,因此选择柱温为45 ℃。

2.4 专属性试验

精密量取空白溶剂及坦西莫司粗品溶液各20 µL,在1.2色谱条件下进样分析,记录色谱图。色谱图如图1、图2所示,从图1、图2可以看出,空白溶剂无干扰,坦西莫司粗品溶液中共有13个杂质峰,多数杂质峰能够达到基线分离,坦西莫司色谱峰形良好,保留时间约为16 min,与相邻色谱峰分离度大于1.5。理论塔板数以坦西莫司峰计大于6000。

图1   空白溶剂色谱图

Fig. 1   Chromatogram of blank solvent

图2   坦西莫司粗品溶液色谱图

Fig .2   Chromatographic diagram of crude temsirolimus solution

2.5 破坏性试验

为考察坦西莫司可能的降解产物及色谱条件的选择是否合理,采用酸、碱、氧化、高温和光照对其进行破坏处理。破坏性试验色谱图如图3所示,从图3中可以看出,空白对照溶液无干扰,坦西莫司在酸、碱、氧化、高温和光照破坏条件下所产生的降解产物均与主峰达到很好的分离,用二极管阵列检测器对各个降解图谱的主峰进行峰纯度分析,其峰纯度均为1.0,均为单一纯色谱峰,表明该方法具有良好的专属性。

 

 

图3   破坏性试验色谱图

Fig .3   HPLC Chromatograms of degradation tests

a—未破坏;b—光照破坏;c—高温破坏;d—碱破坏;e—氧化破坏;f—酸破坏

 

2.6 线性关系、检测限及定量限

分别精密量取对照品储备液0.1、0.5、1、2、3、5 mL,置于10 mL容量瓶中,加入乙腈稀释至标线,摇匀,滤过,在1.2色谱条件下,精密量取20µL注入液相色谱仪中,记录色谱图。以溶液质量浓度(x)为横坐标,对应的色谱峰面积(y)为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明,坦西莫司在质量浓度5.03~251.5 μg/mL的范围内与色谱峰面积线性关系良好,线性方程为y=24.468x-0.177 4,相关系数为0.999 9。

精密量取坦西莫司对照品溶液,用乙腈逐级稀释后进样,以信噪比为3对应的质量浓度作为检出限,以信噪比为10对应质量浓度作为方法定量限,得到检出限、定量限分别为0.012、0.040 μg/mL。

2.7 精密度试验

取批号为20221108的样品,按1.3含量测定溶液方法平行制备6份样品,在1.2色谱条件下进样分析,记录色谱图。计算样品中坦西莫司的含量,考察本方法的精密度,精密度试验结果见表2。由表2可知,坦西莫司平均含量为99.25%,测定结果的相对标准偏差(RSD)为0.10%(n=6),表明该方法精密度良好。

表2   精密度试验结果

Tab. 2   Test results of precision

 

 

2.8 样品加标回收试验

分别精密称取坦西莫司原料5、6.25、7.5 mg,每种浓度3份共9份,分别置于25 mL容量瓶中,然后再称取坦西莫司对照品约5、6.25、7.5 mg,每种浓度3份共9份,分别添加相应的容量瓶中,按1.3方法制备含量溶液,制成低、中、高3种浓度(相当于对照品溶液的80%、100%和120%)的溶液,在按1.2色谱条件下测定,计算加标回收率,样品加标回收试验结果见表3。由表3可知,坦西莫司的平均回收率为100.40%,测定结果的相对标准偏差为0.64%(n=9),表明该方法的准确度较高。

表3   样品加标回收试验结果

Tab. 3   Results of recovery test of spiked samples

 

2.9 稳定性试验

精密称取批号为20221108样品,按1.3方法制备含量测定溶液,按1.2色谱条件,分别在0、2、4、6、8、24 h进样,记录色谱图,稳定性试验结果见表4。由表4可知,坦西莫司峰面积的相对标准偏差为0.72%,表明样品溶液在24 h内稳定性较好。

表4   稳定性试验结果

Tab. 4   Test results of stability

2.10 样品测定

取自制3批样品,按1.3项下方法制备,按照1.2项的色谱条件测定,结果见表5。有关物质测定中最大单个杂质不得过0.1%,杂质总和不得过1.0%,含量测定结果应大于为99.0%,上述样品测定结果均在标准规定的范围内。

表5   坦西莫司样品有关物质测定结果

Tab. 5   Test resuLts of the related substances in temsirolimus samples

 

3、 结语

 

建立了HPLC法测定坦西莫司的含量及有关物质,通过方法学验证,表明该方法灵敏度高、专属性强、简便快捷,可有效地分离检测样品中的杂质及降解产物,可用于坦西莫司的质量控制,为坦西莫司质量标准的制定提供重要依据。该方法为科学评价坦西莫司制剂配方工艺提供可靠的实施途径,具有重要的研究和实际应用价值。

 

 

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引用本文: 王海玲,于泓苓,于雅鑫,等 . 高效液相色谱法测定坦西莫司的含量及有关物质[J]. 化学分析计量,2024,33(7):85. (WANG Hailing, YU Hongling, YU Yaxin, et al. Determination of the content and related substances of temsirolimus by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(7): 85.)

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来源:化学分析计量