摘 要： 建立高效液相色谱法测定坦西莫司的含量及有关物质。使用ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2％（体积分数）磷酸为流动相进行梯度洗脱，流量为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为45 ℃，进样量为20 µL。结果表明，坦西莫司的质量浓度在5.03～251.5 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数为0.999 9，检出限、定量限分别为0.012、0.040 μg/mL。样品的平均回收率为100.40%，测定结果的相对标准偏差为0.64%（n=9）。坦西莫司破坏试验产生的杂质峰能达到良好的检测与分离。该方法专属性强、准确度高、灵敏度好，可用于坦西莫司含量及有关物质的测定。

 

关键词： 坦西莫司； 有关物质； 含量测定； 高效液相色谱法

 

 

坦西莫司是由美国惠氏制药公司研制，于2007年5月经美国FDA批准上市的药物，主要用于晚期肾细胞癌的治疗[1‒2]，也是能够显著延长肾癌患者生存期的药物。最近的研究结果表明，坦西莫司对多种肿瘤细胞具有较好的抗肿瘤活性，包括子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌等[3]。坦西莫司是西罗莫司(雷帕霉素)C42位丙酸酯类衍生物，是西罗莫司靶蛋白(mTOR)的特异性抑制剂[4‒5]。其作用机制是与胞浆蛋白FKBP-12结合并形成复合物，从而抑制mTOR激酶，阻断多条细胞信号传导通路，导致细胞周期在G1到S阶段停滞，抑制细胞生长和增殖，同时降低血管生长因子的水平，阻止肿瘤新生血管的发展，从而发挥抗肿瘤作用[6‒7]。与西罗莫司相比，坦西莫司的亲水性更强，在相同浓度下的抗肿瘤活性也更强[8‒9]，而且药物的不良反应较小[10]。

坦西莫司中杂质的含量直接关系到临床治疗的疗效及安全性，为保证其质量安全可靠，有必要制定更为合理的检测方法来控制坦西莫司中的有关物质。高效液相色谱法用于检测西罗莫司有关物质及含量的方法多有报道[11‒13]，但高效液相色谱法检测血浆中坦西莫司蛋白结合率偶有报道[14‒15]。笔者建立了测定坦西莫司含量及有关物质的高效液相色谱方法，该方法专属性强、灵敏度高、简便快捷，能够对坦西莫司中的杂质以及生产、贮存过程中降解产物等进行有效控制。

 

 

1、 实验部分

 

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC-20AT型，二极管阵列检测器，日本岛津公司。

数控超声波清洗仪：KQ-50E型，江苏昆山市超声仪器有限公司。

紫外分光光度计：UV-2450 PC型，日本岛津公司。

电子天平：NewClassic MS105DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

光照稳定性试验箱：TE-500LA型，上海康励仪器设备有限公司。

坦西莫司对照品：批号为J02H182905，含量99.80%，上海源叶生物科技有限公司。

坦西莫司样品：批号为20221108、20230215、20230320，吉林省药物研究院。

坦西莫司粗品：批号为20221101，吉林省药物研究院。

乙腈：色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

磷酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：A相为乙腈，B相为0.2%(体积分数，下同)磷酸溶液，流量为1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：45 ℃；进样体积：20 μL；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Condition of mobile phase in gradient elution

 

 

1.3 溶液制备

粗品溶液：精密称取坦西莫司粗品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至标线，摇匀滤过，作为样品粗品溶液。

样品溶液：精密称取坦西莫司样品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至标线，摇匀滤过，作为有关物质样品溶液。

对照溶液：精密量取上述样品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，加入乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为有关物质对照溶液。

含量测定溶液：精密量取上述样品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为含量测定溶液。

对照品溶液：精密称取坦西莫司对照品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为对照品储备液。精密量取上述溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为对照品溶液。

空白溶剂：取乙腈溶液作为空白溶剂。

光照破坏溶液：称取样品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释至标线，置于光照箱内照射8 h，摇匀滤过，作为光照破坏溶液。

高温破坏溶液：称取样品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后滴加适量水，于80 ℃水浴加热6 h，取出放冷，加入乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为高温破坏溶液。

碱破坏溶液：称取样品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后，加入0.1mol/L氢氧化钠1 mL，室温放置5 min，然后用0.1 mol/L盐酸调pH为中性，加入乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为碱破坏溶液。

氧化破坏溶液：称取样品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后，加入30%过氧化氢1 mL，室温放置24 h，然后加入乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为氧化破坏溶液。

酸破坏溶液：称取样品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后，加入1 mol/L盐酸1 mL，常温放置1 h，然后用1 mol/L氢氧化钠调pH为中性，加入乙腈稀释至标线，摇匀滤过，作为酸破坏溶液。

1.4 实验步骤

取对照品溶液及含量测定溶液，在1.2仪器工作条件下进样分析，记录色谱图峰面积，按外标法计算样品的含量。取样品溶液及样品对照溶液，在1.2色谱条件下进样分析，记录3倍坦西莫司峰保留时间下的色谱图，按主成分自身对照法计算杂质含量。

 

 

2、 结果与讨论

 

 

2.1 检测波长的选择

精密吸取坦西莫司对照品溶液适量，加入乙腈稀释，配制成10 μg/mL的溶液，按照紫外-可见分光光度法在200～400 nm波长处扫描，结果表明在280 nm波长处有最大吸收。在破坏性试验中，大多数降解产物均在280 nm波长处有较强的紫外吸收，主成分坦西莫司在280 nm波长处也有吸收，因此检测波长均选定为280 nm。

2.2 流动相的选择

有关物质条件摸索时选择不同配比的乙腈和水做流动相，发现主峰峰形不好、拖尾严重，与相邻的杂质峰分离度小于1.5。因该化合物为弱酸性，若在流动相中加入少量酸如磷酸溶液，可以消除峰拖尾现象，因此选用乙腈与不同浓度的磷酸作流动相。以乙腈与0.1%磷酸作为流动相时，主峰峰形较好，但是与相邻的杂质峰分离度小于1.5；以乙腈与0.2%磷酸作为流动相，初始体积比为65：35，进行梯度洗脱，主峰保留时间约为16 min，与相邻的杂质峰分离度大于1.5，所有色谱峰能达到基本分离，最终选择乙腈-0.2%磷酸作为流动相。

2.3 柱温的选择

考察柱温35、40、45、50 ℃时，坦西莫司主成分色谱保留时间、理论塔板数以及主峰与相邻杂质峰的分离度。结果表明，随着柱温升高，主峰出峰时间略有提前，主峰与相邻杂质峰的分离度有增加趋势。45 ℃和50 ℃没有显著区别，考虑到较低的柱温更适用于延长色谱柱的寿命，因此选择柱温为45 ℃。

2.4 专属性试验

精密量取空白溶剂及坦西莫司粗品溶液各20 µL，在1.2色谱条件下进样分析，记录色谱图。色谱图如图1、图2所示，从图1、图2可以看出，空白溶剂无干扰，坦西莫司粗品溶液中共有13个杂质峰，多数杂质峰能够达到基线分离，坦西莫司色谱峰形良好，保留时间约为16 min，与相邻色谱峰分离度大于1.5。理论塔板数以坦西莫司峰计大于6000。

图1   空白溶剂色谱图

Fig. 1   Chromatogram of blank solvent

图2   坦西莫司粗品溶液色谱图

Fig .2   Chromatographic diagram of crude temsirolimus solution

2.5 破坏性试验

为考察坦西莫司可能的降解产物及色谱条件的选择是否合理，采用酸、碱、氧化、高温和光照对其进行破坏处理。破坏性试验色谱图如图3所示，从图3中可以看出，空白对照溶液无干扰，坦西莫司在酸、碱、氧化、高温和光照破坏条件下所产生的降解产物均与主峰达到很好的分离，用二极管阵列检测器对各个降解图谱的主峰进行峰纯度分析，其峰纯度均为1.0，均为单一纯色谱峰，表明该方法具有良好的专属性。

 

 

图3   破坏性试验色谱图

Fig .3   HPLC Chromatograms of degradation tests

a—未破坏；b—光照破坏；c—高温破坏；d—碱破坏；e—氧化破坏；f—酸破坏

 

2.6 线性关系、检测限及定量限

分别精密量取对照品储备液0.1、0.5、1、2、3、5 mL，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈稀释至标线，摇匀，滤过，在1.2色谱条件下，精密量取20µL注入液相色谱仪中，记录色谱图。以溶液质量浓度(x)为横坐标，对应的色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，坦西莫司在质量浓度5.03～251.5 μg/mL的范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性方程为y=24.468x-0.177 4，相关系数为0.999 9。

精密量取坦西莫司对照品溶液，用乙腈逐级稀释后进样，以信噪比为3对应的质量浓度作为检出限，以信噪比为10对应质量浓度作为方法定量限，得到检出限、定量限分别为0.012、0.040 μg/mL。

2.7 精密度试验

取批号为20221108的样品，按1.3含量测定溶液方法平行制备6份样品，在1.2色谱条件下进样分析，记录色谱图。计算样品中坦西莫司的含量，考察本方法的精密度，精密度试验结果见表2。由表2可知，坦西莫司平均含量为99.25%，测定结果的相对标准偏差（RSD）为0.10%(n=6)，表明该方法精密度良好。

表2   精密度试验结果

Tab. 2   Test results of precision

 

 

2.8 样品加标回收试验

分别精密称取坦西莫司原料5、6.25、7.5 mg，每种浓度3份共9份，分别置于25 mL容量瓶中，然后再称取坦西莫司对照品约5、6.25、7.5 mg，每种浓度3份共9份，分别添加相应的容量瓶中，按1.3方法制备含量溶液，制成低、中、高3种浓度(相当于对照品溶液的80%、100%和120%)的溶液，在按1.2色谱条件下测定，计算加标回收率，样品加标回收试验结果见表3。由表3可知，坦西莫司的平均回收率为100.40%，测定结果的相对标准偏差为0.64%(n=9)，表明该方法的准确度较高。

表3   样品加标回收试验结果

Tab. 3   Results of recovery test of spiked samples

 

2.9 稳定性试验

精密称取批号为20221108样品，按1.3方法制备含量测定溶液，按1.2色谱条件，分别在0、2、4、6、8、24 h进样，记录色谱图，稳定性试验结果见表4。由表4可知，坦西莫司峰面积的相对标准偏差为0.72%，表明样品溶液在24 h内稳定性较好。

表4   稳定性试验结果

Tab. 4   Test results of stability

2.10 样品测定

取自制3批样品，按1.3项下方法制备，按照1.2项的色谱条件测定，结果见表5。有关物质测定中最大单个杂质不得过0.1%，杂质总和不得过1.0%，含量测定结果应大于为99.0%，上述样品测定结果均在标准规定的范围内。

表5   坦西莫司样品有关物质测定结果

Tab. 5   Test resuLts of the related substances in temsirolimus samples

 

3、 结语

 

建立了HPLC法测定坦西莫司的含量及有关物质，通过方法学验证，表明该方法灵敏度高、专属性强、简便快捷，可有效地分离检测样品中的杂质及降解产物，可用于坦西莫司的质量控制，为坦西莫司质量标准的制定提供重要依据。该方法为科学评价坦西莫司制剂配方工艺提供可靠的实施途径，具有重要的研究和实际应用价值。

 

 

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引用本文： 王海玲，于泓苓，于雅鑫，等 . 高效液相色谱法测定坦西莫司的含量及有关物质［J］. 化学分析计量，2024，33（7）：85. (WANG Hailing, YU Hongling, YU Yaxin, et al. Determination of the content and related substances of temsirolimus by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(7): 85.)