脂质体是磷脂在水中形成的一种具有磷脂双分子层的囊泡，粒径一般在40 ～ 200 nm。脂质体作为药物载体广泛应用，药物一般包封于脂质双分子层或内水相中。包封率是脂质体的关键质量属性，它指的是包封在脂质中的药物含量占总投药量的百分比，能反映出脂质体中药物包封程度的高低，以指导制备工艺的改进。由于包封药物性质不同，脂质体形式不同，大小不同，包封率测定方法往往需要实验考察，本文总结了包封率测定常用的一些方法，为脂质体包封率测定的方法选择提供一些参考。

1.     离心法：

原理：游离药物与含药脂质体在介质中的不同溶解性、离心力实现分离。脂溶性的游离药物不溶于脂质体所需的水相介质，而悬浮在体系中，采用相对较小的离心强度和较短的离心时间，这些未溶的游离药物会因离心力的作用而沉降，但脂质体仍存在于上清液中，从而实现分离。超速离心则适合水溶性的药物，超速离心后脂质体会沉降而水溶性的药物则溶解在上清液中实现分离。

优势：简单、快速、成本较低。

缺点：离心脂质体容易破裂，小粒径脂质体和游离药物分离困难。

举例：大黄酚脂质体游离药物容易行程颗粒结晶，采用低速离心法用空白脂质体加上不同浓度的游离药物考察离心强度（500-3000r/min）、离心时间（30-180S）、间歇和连续离心（1-8次）确定了包封率测定方法。

2.     超滤离心

原理：超滤离心法是将脂质体放入配有超滤膜的超滤管中，在适宜的转速下离心，游离药物在离心力的作用下可通过超滤膜，而脂质体则被截留，从而实现二者的分离。

优势：简单，快速，不需要稀释

缺点：脂溶性药物或者蛋白质等容易聚集的药物不能透过超滤膜比较适用于水溶性药物，但需要注意浓度极差现象发生（高浓度脂质体截留在超滤膜上影响游离药物通过），可尝试通过稀释和高速离心来解决。但高速离心容易导致脂质体破裂。

举例：甘草次酸脂质体的包封率测定使用超滤离心法，考察超滤膜对空白脂质体透过能力，游离药物回收率、超滤加样回收率，离心速度对药物泄露影响等参数，最终确定了包封率测定方法。

3.     凝胶柱法

原理：葡聚糖颗粒在溶胀后可形成凝胶状结构，其内部具有一定大小的孔径，小分子游离药物可进入孔内，实现一定程度的保留；而脂质体粒径大于凝胶孔径，脂质体无法进入孔内，于是少量洗脱液便可将其洗脱下来。

优势：分离效果较好，不受药物溶解性影响

缺点：大量洗脱液，可能导致脂质体破裂。对吸附力较强的脂质体洗脱困难，不太适用。一般可通过加大脂质体样品上柱量或用空脂质体预先将柱子饱和来尝试解决。

相比葡聚糖凝胶柱法，微柱离心法加入的洗脱液体积大大减小，避免了脂质体因稀释作用而发生的泄漏。此法是将溶胀好的葡聚糖凝胶或经预处理的离子交换树脂装入注射器中，反复平衡、离心后制成干燥的微柱，然后在其顶端加入脂质体混悬液，静置几分钟后再加入洗脱液，设置适宜的离心转速将脂质体洗脱下来。

举例：采用微柱离心⁃ＨＰＬＣ 测定胰岛素脂质体的包封率，考察了装填方式，洗脱介质，脂质体和游离药物的吸附，上样体积，洗脱体积、洗脱次数等确定洗脱曲线分离脂质体和游离药物。

4.     固相萃取法

原理：固相萃取法利用的是色谱吸附原理，游离药物被吸附在极性相近的 SPE 柱固定相上，而脂质体在 SPE 柱上无保留，少量水便可洗脱下来。

优势：简单快速，分离效果好

缺点：对药物性质要求较高，游离需要与SPF吸附性较强

举例:紫杉醇脂质体采用固相萃取方法进行分离，对C18填料粒径，筛板极性，洗脱体积进行优化确定了包封率测定方法。

5.     荧光法

原理：

Ri液状态时，几乎没有荧光活性，与游离药物结合时，其荧光活性将增加1000倍。荧光检测器检测得到游离药物浓度。分别测定游离药物浓度，以及总的药物浓度，两者的差值就是包封的药物浓度。通过计算得到包封率结果。

优势：不需要分离脂质体和游离药物，检测快速

缺点：适合产生荧光的药物，一般用于mRNA、siRNA、pDNA等核酸检测

举例：将 RiboGreen 荧光染料加 入到共载米铂与核酸 miR-34a 阳离子脂质体溶液中，游离的 miR-34a 分子会与 RiboGreen 染料结合产生荧光，利用外标法可以计算出游离miR-34a的 浓度，另取一份脂质体破乳后测定 miR-34a 总浓 度，从而计算出包封率。

6.     纳米粒子排阻色谱（nPEC）

原理：在nPEC固定相表面涂覆聚乙烯吡咯烷酮，以减少脂质体对固定相中硅醇基的吸附。此外，固定相具有um-size的微孔和nm-size的介孔组成的双峰结构。与填料柱相比，采用这种设计的整体柱具有更低的背压，产生更低的剪切力。双峰结构允许脂质体容易流过微孔(2微米)，而游离药物可以有效地穿透介孔(18纳米)，这使得脂质体制剂中的游离药物可以同时分离和定量。采用HPLC方法测定总药物含量，从而计算出包封率。

优势：不需要分离脂质体和游离药物，检测快速

缺点：技术较新，目前应用不广泛

举例：文献报道了采用nPEC 方法测定水溶性药物阿霉素脂质体和一种疏水性药物脂质体的包封率，通过分离效果确定流动相、流速、保留时间等色谱参数，并对色谱条件下脂质体的完整性进行研究，最终对确定的色谱方法进行方法验证符合要求。

总结：除上述方法外，包封率测定方法还有鱼精蛋白法，透析法等。总体而言，脂质体包封率检测方法选择需要依据药物的物理化学性质和各种方法的特点来选择，有些方法对药物选择性较高，如：鱼精蛋白法适合带负电和中性的脂质体，荧光法适合有荧光反应的药物，这些方法可以作为具有这些性质药物的首选。超滤膜的材料和截留分子量有多种类型，可满足试验者的多重需要因此超滤法适用范围较广。凝胶柱和固相萃取法需要药物在柱子中有一定保留，但吸附能力不能太强，此外，大量稀释可能导致脂质体破裂。纳米粒子排阻色谱不需要对脂质体和游离药物进行分离，适用范围比较广，但需要摸索合适的色谱参数。不管采用何种方法，脂质体的完整性及脂质体与游离药物的分离度都是需要考虑的重点内容。如果药物适用，通过不同方法的相互印证，可以更加准确的测出脂质体的包封率。

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