摘 要： 以枸杞为原料，通过水提醇沉方式得到枸杞粗多糖，建立柱前衍生-气相色谱法测定枸杞粗多糖中4种糖醛酸（D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-半乳糖醛酸）的含量。采用三氟乙酸作为水解剂，于120 ℃水解90 min，采用HP-1701毛细管色谱柱分离，分流比为15∶1，氢火焰离子化检测器（FID）检测，外标法定量。结果表明，4种糖醛酸的质量浓度在0～100 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999。样品加标回收率为90.55%～96.40%，测定结果的相对标准偏差均小于10%（n=6）。该方法满足枸杞粗多糖中糖醛酸含量的检测。

关键词： 气相色谱； 枸杞； 粗多糖； 糖醛酸

 

 

枸杞，为茄科枸杞属多年生木本植物，是一种药食同源的营养保健蔬菜和名贵中药。枸杞多糖是一种水溶性多糖，是枸杞中最主要的活性成分，是国内外研究者们关注的热点。现已有大量研究表明，枸杞多糖具有促进免疫、抗衰老、抗肿瘤、清除自由基、抗疲劳、抗辐射、保肝以及改善生殖功能等作用[1‒6]。

糖醛酸是指糖中的伯羟基被氧化成羧基后形成的化合物及其衍生物，此类化合物易于形成内酯，糖醛酸通常以吡喃糖和呋喃糖形式与相应的内酯处于平衡状态。天然存在的糖醛酸以与糖苷配基结合的糖醛酸苷形式或聚糖醛酸的形式存在，是树胶质、果胶、半纤维素、藻酸、细菌多糖等细胞壁或黏液物质的主要成分。糖醛酸在人体内具有多种生理功能，如诱导细胞凋亡、抗氧化性、保护细胞免受损害等[7‒11]，因此测定糖醛酸含量对于评估食物的营养价值和生物活性至关重要。

目前，对于多糖中单糖的含量测定报道较多[12‒15]，但针对多糖中糖醛酸含量的测定方法鲜见。笔者采用柱前衍生技术，建立气相色谱(GC)测定枸杞粗多糖中D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-半乳糖醛酸4种糖醛酸的分析方法，该方法灵敏、准确、重现性好，为评估枸杞的营养价值和生物活性，促进枸杞在多领域的开放利用与科学研究提供一定的技术支持。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

气相色谱仪：7890B型，配FID检测器，美国安捷伦科技有限公司。

纯水/超纯水一体化系统：Milli-Q Direct-Q8型，美国密理博公司。

电子分析天平：BSA224S型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

三氟乙酸：分析纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

甲醇：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

乙酸、正丙胺、吡啶、乙酸酐：均为分析纯，中国医药集团有限公司。

三氯甲烷：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司。

D-葡萄糖醛酸标准品：纯度（质量分数，下同）为99.9%，标准物质编号为GBW(E) 76955，坛墨质检标准物质中心。

L-艾杜糖醛酸标准品：纯度不小于98.0%，标准物质编号为GBW(E) ZG-31380，上海安谱实验科技有限公司。

D-甘露糖醛酸标准品：纯度为99.0%，标准物质编号为GBW(E) 2298895，四川省维克奇生物科技有限公司。

D-半乳糖糖醛酸标准品：纯度为99.7%，标准物质编号为GBW(E) 77375，坛墨质检标准物质中心。

枸杞样品：市售。

实验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：HP-1701型毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；进样口温度：250 ℃；分流比：15∶1；FID温度：280 ℃；升温程序：初始炉温为50 ℃，保持1 min，以6 ℃/min升温至180 ℃，以5 ℃/min升温至260 ℃，保持10 min。

1.3 溶液配制

糖醛酸混合标准储备溶液：分别准确称取4种糖醛酸标准品各10 mg于10 mL容量瓶中，加水定容至标线，得4种糖醛酸质量浓度均为1 000 μg/mL的混合标准储备溶液。

糖醛酸系列混合标准工作溶液：分别准确移取质量浓度为1 000 μg/mL混合标准储备溶液0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL于10 mL容量瓶中，加水定容至标线，得质量浓度分别为0、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 μg/m的系列混合标准工作溶液。

1.4 实验方法

1.4.1 糖醛酸标准工作溶液衍生化反应

分别准确移取0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL 4种糖醛酸混合标准储备溶液，均加水至2 mL，加入10 mg硼氢化钠，于室温放置约1 h，滴加1 mL乙酸除去多余的硼氢化钠，于80 ℃减压蒸干，期间分2～3次加入约5 mL甲醇，蒸干去除硼酸盐，于烘箱中90 ℃下加热2 h，将糖醛酸转变为内酯，将残渣溶于1 mL吡啶中，加入1 mL正丙胺，密封，于55 ℃加热30 min，冷却，氮气吹干，残渣依次加入1 mL吡啶和1 mL乙酸酐，密封，于90 ℃加热30 min，冷却，加入1.0 mL三氯甲烷溶解，水洗2～3次，吸取下层溶液作为糖醛酸标准衍生物溶液。

1.4.2 枸杞粗多糖的提取

称取500 g干枸杞，捣碎，使用95%(体积分数，下同)的乙醇溶液回流除去脂肪，残渣于90 ℃烘箱烘干后称其质量，用20倍量的水在80 ℃的条件下提取2 h，过滤，重复提取1次，合并滤液，浓缩至一定体积，离心，取上清液，在不断搅拌下加入95%乙醇溶液使得溶液中乙醇溶液的最终体积分数为70%，静置10 h，离心，收集沉淀，冷冻干燥，得到枸杞粗多糖。

1.4.3 样品衍生化反应

准确称取枸杞粗多糖100 mg于水解管中，加入5 mL 2 mol/L 三氟乙酸，充氮气1 min，将水解管密封，于120 ℃水解90 min，减压浓缩至干，再分2～3次加入甲醇蒸干去除多余三氟乙酸，以后操作过程同1.4.1。

1.4.4 样品测定

移取适量衍生样品溶液，经0.22 μm滤膜过滤后，注入气相色谱仪测定，依据色谱峰面积外标法进行定量分析。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 水解剂的选择

多糖的水解一般采用的方式为酸水解，常见可供选择的酸包括乙酸、盐酸、硫酸、三氟乙酸、磷酸等。采用相同浓度(2 mol/L)的乙酸、盐酸、硫酸、三氟乙酸、磷酸5种酸水解剂分别对枸杞粗多糖进行水解，4种糖醛酸衍生物色谱峰面积变化情况如图1所示。从图1可以看出，采用三氟乙酸作为水解剂水解后4种糖醛酸衍生物峰面积均高于其他4种酸，水解效率最高，因此选择三氟乙酸作为水解剂。

图1   5种酸水解枸杞粗多糖中4种糖醛酸衍生物色谱峰面积

Fig. 1   Chromatographic peak area of four uronic acid derivatives in five kinds of acid hydrolyzed Lycium barbarum crude polysaccharides

2.2 水解温度的选择

称取枸杞粗多糖100 mg，经1.4.3处理，其他条件不变，考察水解温度分别为90、100、110、120、130、140、150 ℃下对4种糖醛酸衍生物色谱峰面积的影响，如图2所示。从图2可以看出，水解温度为90～120 ℃时，随着水解温度升高，4种糖醛酸衍生物的峰面积均有所增加，当水解温度达到120 ℃时，4种糖醛酸衍生物的峰面积均基本趋于稳定，同时考虑到水解温度过高可能会导致目标物结构破坏，影响检测结果，因此采用120 ℃作为水解温度。

图2   不同水解温度下枸杞粗多糖水解后4种糖醛酸衍生物的色谱峰面积

Fig. 2   Effect of hydrolysis temperature on the peak area of four uronic acid derivatives of Lycium barbarum crude polysaccharides after hydrolysis

2.3 水解时间的选择

称取枸杞粗多糖100 mg，经1.4.3处理，考察水解温度分别为30、60、90、120、150 min下对4种糖醛酸衍生物色谱峰面积的影响，如图3所示。从图3可以看出，水解时间小于60 min时，随着平衡时间延长，4种糖醛酸衍生物的色谱峰面积均有所增加，当水解时间为90 min时达到动态平衡状态，当平衡时间继续延长，4种糖醛酸衍生物峰面积均无明显增加。同时，水解时间过长可能会导致杂质峰的增加，因此选择水解时间为90 min。

图3   不同水解时间对应的枸杞粗多糖水解后4种糖醛酸衍生物色谱峰面积

Fig. 3   Effect of hydrolysis time on the peak area of four uronic acid derivatives of Lycium barbarum crude polysaccharides after hydrolysis

2.4 色谱柱的选择

考察HP-5柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、HP-1701柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、CD-624柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、HP-INNOWAX柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)4种常见色谱柱的分离效果，结果表明，HP-1701色谱柱的分离效果最佳，HP-INNOWA的分离效果最差，HP-5柱与CD-624柱分离对于D-葡萄糖醛酸、D-甘露糖醛酸两种糖醛酸色谱峰分离效果较差，同时柱箱升温程序对4种糖醛酸分离度也存在一定影响。经过多次试验发现，采用HP-1701色谱柱，4种糖醛酸分离效果佳，混合标准溶液色谱图如图4所示。

 

  1—D-葡萄糖醛酸衍生物；2—D-甘露糖醛酸衍生物；3—L-艾杜糖醛酸衍生物；4—D-半乳糖醛酸衍生物图4　4种糖醛酸标准混合溶液色谱图

Fig. 4   GC spectrum of standard mixed solution of uronic acid

2.5 分流比的选择

理论上来说，分流比越低，灵敏度就越高，但D-葡萄糖醛酸与D-甘露糖醛酸，L-艾杜糖醛酸与D-半乳糖醛酸在气相色谱图中出峰位置接近，容易相互干扰，从而影响到分离效果，可能造成定量的不准确。通过实验摸索，最终选择15∶1的分流比，一方面减少两者进入到色谱柱产生的干扰，另一方面保证了检测的灵敏度。

2.6 线性关系、检出限与定量限

取糖醛酸混合标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下进样测定，分别以4种糖醛酸标准工作液的质量浓度（x）为横坐标，其色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限。4种糖醛酸的线性范围、线性方程、相关系数、检出限与定量限见表1，由表1可知，4种糖醛酸的质量浓度在0～100 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数r均大于0.999。

表1   4种糖醛酸质量浓度的线性范围、线性方程、相关系数、检出限与定量限

Tab. 1   Linear relationship，detection limit and quantification limit

 

2.7 加标回收及精密度试验

称取枸杞粗多糖试样100 mg，分别加入质量浓度为1.0 μg/mL的混合标准溶液20、100、1 000 μL，按照1.4.3步骤处理后测定，每组样品平行测定6次，测定结果见表2。加标前样品与加标后样品色谱图如图5所示，由表2可知，4种糖醛酸相对标准偏差（RSD）为2.38%～6.19%(n=6)。4种糖醛酸平均回收率为90.55%～96.40%，该方法精密度、准确度满足分析要求。

表2   加标回收及精密度试验结果

Tab. 2   Precision and standard addition recovery test results

图5   枸杞粗多糖及加标枸杞粗多糖样品的气相色谱图

 

Fig. 5   GC spectrumof Lycium barbarum crude polysaccharide and spiked Lycium barbarum crude polysaccharide samples

 

1—D-葡萄糖醛酸衍生物；2—D-甘露糖醛酸衍生物；3—L-艾杜糖醛酸衍生物；4—D-半乳糖醛酸衍生物

 

3、 结语

 

以枸杞粗多糖为检测对象，通过对水解及色谱条件的选择和优化，建立柱前衍生-气相色谱法测定枸杞粗多糖中糖醛酸的含量。该方法灵敏度高、准确性好、重现性佳，可为枸杞样品中多糖的结构组成及其活性研究提供技术支持与数据参考。

 

 

参考文献：

 

1 朋毛德吉，贾慧萍，胡樱，等.黑果枸杞多糖的提取纯化、化学组分及功能活性研究进展［J］.粮食与油脂，2023，36（12）：34.

    PENG Maodeji，JIA Huiping，HU Ying，et al. Research progress on the extraction，purification，chemical composition，and functional activity of polysaccharides from black fruit goji berries［J］. Grain and Oil，2023，36（12）：34.

 

2 张荣，古丽吉合热·阿布拉.新疆黑枸杞原花青素的提取及抗氧化活性研究［J］.食品工业，2023，44（12）：27.

    ZHANG Rong，GU Lijihe Abra. Extraction and antioxidant activity of proanthocyanidins from Xinjiang black goji berries［J］. Food Industry，2023，44（12）：27.

 

3 郑玄，陈志.枸杞活性成分对于抗癌靶点的分子对接研究［J］.青海草业，2023，32（4）：18.

    ZHENG Xuan，CHEN Zhi. Molecular docking study of active ingredients in goji berries on anti-cancer targets ［J］. Qinghai Grass Industry，2023，32（4）：18.

 

4 赵耘苹，杨稀瑞，刘瑞宝，等.枸杞多糖对青光眼患者视网膜神经节细胞保护作用的研究进展［J］.中华实用诊断与治疗杂志，2023，37（11）：1 176.

    ZHAO Yunping，YANG Xirui，LIU Ruibao，et al. Research progress on the protective effect of goji berry polysaccharides on retinal ganglion cells in glaucoma patients［J］. Chinese Journal of Practical Diagnosis and Treatment，2023，37（11）：1 176.

 

5 潘菲，李玉丽，李玉林等.五产区黑果枸杞化学成分测定及综合比较［J］.中华中医药杂志，2023，38（11）：5 474.

    PAN Fei，LI Yuli，LI Yulin，et al. Chemical composition determination and comprehensive comparison of black fruit goji berries from five production areas［J］. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine，2023，38（11）：5 474.

 

6 苑雪彤，邱向阳，刘志惠，等.酶辅助超声提取黑果枸杞多糖工艺及其保肝活性研究［J］.沈阳药科大学学报，2023，40（10）：1 366.

    YUAN Xuetong，QIU Xiangyang，LIU Zhihui，et al. Enzymatic assisted ultrasound extraction of polysaccharides from black fruit goji berries and their hepatoprotective activity［J］. Journal of Shenyang Pharmaceutical University，2023，40（10）：1 366.

 

7 梁立娜，张萍，蔡亚岐，等.高效阴离子交换-脉冲安培检测同时分析单糖和糖醛酸［J］.分析化学，2006（10）：1 371.

    LIANG Lina，ZHANG Ping，CAI Yaqi，et al. Simultaneous analysis of monosaccharides and uronic acids using efficient anion ex-change pulse amperometric detection［J］. Analytical Chemistry，2006（10）：1 371.

 

8 李波，芦菲，田素玉.气相色谱法同时测定多糖中的中性糖、糖醛酸、氨基糖和唾液酸［J］.食品与发酵工业，2011，37（9）：208.

    LI Bo，LU Fei，TIAN Suyu. Simultaneous determination of neutral sugars，uronic acid，amino sugars，and sialic acid in polysaccharides by gas chromatography［J］. Food and Fermentation Industry，2011，37（9）：208.

 

9 刘莉，王志鹏，梅其炳，等.大黄多糖提取工艺对糖含量和糖醛酸含量的影响［J］.中国药学杂志，2003（10）：20.

    LIU Li，WANG Zhipeng，MEI Qibing，et al. The effect of extraction process of rhubarb polysaccharides on sugar content and uronic acid content［J］. Chinese Journal of Pharmacy，2003（10）：20.

 

10 李亚平，周鸿立.多糖中糖醛酸含量测定方法的研究进展［J］.食品研究与开发，2019，49（17）：207.

    LI Yaping，ZHOU Hongli. Research progress on the determination method of uronic acid content in polysaccharides ［J］. Food Research and Development，2019，49（17）：207.

 

11 陈巧巧，万琴，王振中，等.人参多糖中糖醛酸含量测定方法的建立［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：121.

    CHEN Qiaoqiao，WAN Qin，WANG Zhenzhong，et al. Establishment of a method for determining the content of uronic acid in ginseng polysaccharides［J］. Chinese Journal of Experimental Formulas，2012，18（8）：121.

 

12 徐洲，达小梅. PMP柱前衍生HPLC法测定松乳菇多糖的单糖组成［J］.西昌学院学报（自然科学版），2023，37（3）：1.

    XU Zhou，DA Xiaomei. PMP pre column derivatization HPLC method for determining the monosaccharide composition of polysaccharides from Pleurotus matsutake［J］. Journal of Xichang University （Natural Science Edition），2023，37（3）：1.

 

13 徐双双，吴思佳，卢文旭，等. HPLC-CAD法同时测定铁皮石斛中单糖和寡糖类成分的含量［J］.药物分析杂志，2023，43（8）：1 302.

    XU Shuangshuang，WU Sijia，LU Wenxu，et al. Simultaneous determination of monosaccharides and oligosaccharides in Dendrobium officinale by HPLC-CAD method［J］. Journal of Pharmaceutical Analysis，2023，43（8）：1 302.

 

14 许玮仪，姜振邦，范晶，等.离子色谱-积分脉冲安培法测定肉苁蓉多糖的单糖组成及游离单糖含量［J］.药学学报，2023，58（8）：2 476.

    XU Weiyi，JIANG Zhenbang，FAN Jing，et al. Determination of Monosaccharide Composition and Free Monosaccharide Content of Cistanche deserticola Polysaccharides by Ion Chromatography Integrated Pulse Amperometry［J］. Journal of Pharmacy，2023，58（8）：2 476.

 

15 金敏.基于HPAEC-HRMS技术的植物多糖中单糖组成及含量测定研究［D］.沈阳：中国医科大学：2023.

    JIN Min. Study on monosaccharide composition and content determination in plant polysaccharides based on HPAEC-HRMS technology［D］. Shenyang：China Medical University：2023.

 

引用本文： 崔艳华，黄牧坤，李灿，等 . 柱前衍生-气相色谱法测定枸杞粗多糖中4种糖醛酸［J］. 化学分析计量，2024，33（7）：74. (CUI Yanhua, HUANG Mukun, LI Can, et al. Determination of four uronic acids in crude lycium barbarum polysaccharides by pre-column derivatization-gas chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(7): 74.)