在清洁消毒验证中采用适当的取样技术是必要的。取样过程中涉及的技术方法应与设备表面和研究本质相适应，包括使用的分析方法。这一部分讨论了取样方法的类型，验证取样回收研究以及取样人员的培训及资质。

1  、取样方法选择

取样方法的选择取决于设备性质以及检测残留物的性质。此处讨论的取样方法是直接表面取样，擦拭取样， 冲洗水取样以及空白对照取样。值得注意的是法规文件中指出擦拭被认为是 “直接” 取样，冲洗水取样被认为是“间接”取样，所指的取样方法如“擦拭取样”和“冲洗水取样”是更可取并且更好被描述的，技术上保留“直接取样”的术语，比如使用目测检查。

1、 直接取样方法

清洁过程中应除去设备表面上来自于生产工艺可见残留，这一点是被广泛认可的。设备的目测检查具有局限性，因为一些设备表面（比如管道）通常是不易观察的。像镜子或者内视镜之类的光学仪器的使用作为辅助照明能够帮助进行目测检查。

当由经过培训的人员由于要接触设备表面而难以进行目检时或者是补充 “未受协助” 的目检程序时，远程检查技术（纤维光学探头以及 LCD 观察屏）被应用。

管道内窥镜，纤维内窥镜以及光纤视镜允许对难以达到的区域进行目检。管道内窥镜用于观察管道内部和水槽焊接点。这些范围的典型好处是：适用于操作人员接触不到的密闭空间；易操作，具有辅助照明并且具有选择性放大和/或提升的能力。这些范围的最大缺点是使用复杂， 控制照明/亮度，并且操作人员需要判断该区域是否能够清晰可见。

远程可视相机允许操作人员在屏幕上观察远程区域。相机与范围具有大部分相同的优势和劣势，而更多的优势是操作人员能够代表性的记录视频或者拍照。多个操作人员能够同时观察到屏幕显示了什么。记录视频以及允许多个观察者观察屏幕的可能性可以帮助支持厂区目检培训程序。来自相机的打印的图片可能扭曲残留的实际数量，因为操作人员将在特殊区域内聚焦，当拍照时。

所有这些的技术，像是目检，要求具有充足的培训程序。

2、 冲洗取样

冲洗取样涉及对设备取样通过流水冲洗所有相关设备表面移除残留，残留将在冲洗水中进行测量。大部分冲洗取样技术是在清洁过程中的最终冲洗中通过从最终冲洗水中提取随机样品。另一个选择是在完成清洁程序后，用水填满整个设备。然后，取大部分样品进行分析。第三个选择是使用单独的 CIP 取样冲洗定量，在最终冲洗完成后。

冲洗水取样的一个特殊情况就是小部件取样。冲洗取样的一种方法就是小部件提取。提取过程中，提取液（生物技术残留的典型水）被放置在清洁的容器中。之后小部件被放置在提取液中并且在固定的时间进行摇动或者超声处理。之后对样品溶液进行分析可能存在的残留。对于小部件冲洗取样的第二种方法典型的用于具有孔口的部件， 比如灌装针头。在这个程序中， 定量的样品溶液 （再次，代表性的水）通过内腔并在洁净的收取容器中收集。匀速摇动样品溶液，之后对可能存在的残留进行分析。因为表面区域和取样量是精确已知的，对于这种情况，能够精确计算限度。

3、 擦拭取样

擦拭取样涉及使用纤维材料擦拭表面（最一般的）。擦拭过程中，表面的残留被转移至纤维材料上。随后纤维材料被放置在溶剂中，将残留转移至溶剂中。之后采用可接受的分析技术对溶剂进行残留分析。最常见的纤维材料是带有塑料手柄的一些纺织物（针织的，梭织的或者无纺布的）。

大部分情况下，在对表面取样前棉签是湿的并且带有溶剂。对于TOC和电导的方法，溶剂大部分情况下总是水。对于同样位置的取样，公司可能选择取样同样的表面积进行多次擦拭，以提供表面更高的残留回收率。在这些情况下，使用的附加擦拭可以是干擦或者具有同样溶剂的湿擦。

2 、空白对照取样

在生物工程中，空白对照取样通常不包括实际产品的空白对照，相反的，只包括注射用水或者没有任何产品的水性处理缓冲液。在取样过程中，设备被清洁。随着清洁只用注射用水或者缓冲液进行生产加工过程。随着加工，注射用水或者缓冲液被认为是任何其他的清洁确认样品，尤其是对TOC（或总蛋白），电导率，生物载荷以及内毒素，作为具有这些残留的生产产品可能存在的污染的测量。对于散装和制剂/灌装生产进行的空白对照显示了真实的到处理过材料的遗留。

3  、微生物以及内毒素分析取样

生物载荷的取样涉及冲洗水取样，擦拭或者接触碟。生物载荷的冲洗水取样必须包括无菌取样容器的使用。一个细致的取样技术对任何微生物方法都是被要求的，以避免取样的外部污染。

内毒素取样总是采用冲洗水取样。关于微生物评估的这些取样技术，对于生物技术不是唯一的。

4 、取样回收研究

取样回收研究一般都是要求的，充分显示如果存在在设备表面，残留能够通过分析方法的结合和取样程序进行监测和定量。这些研究为使用检测残留的取样和分析方法提供了科学依据。下面讨论了三种取样回收：擦拭取样回收，冲洗水取样回收以及“目检”回收。

对于擦拭和冲洗水取样，回收研究作为分析方法验证的一部分进行，或者可以作为单独的研究进行，一旦决定分析方法能够在溶液中检测出残留。取样回收研究是实验室研究，包括不同材质的被取样设备的取样片（如，不锈钢，玻璃，PTFE和硅胶），带有残留以检测。

1、 总则

回收研究对于已知是水溶的并且低于溶解限度的某些残留是不需要的，如，作为清洁剂的氢氧化钠或者磷酸。

在进行擦拭和冲洗水取样回收研究中，带有材质的取样片的数量应代表等同于代表残留限度的数量，这也代表了最差条件。

标记的残留应是与警戒过程结束时出现的一样的残留。对于生物技术蛋白活性物，实际是降解的蛋白质碎片。但是惯例做法是标记主体蛋白活性物质，因为这样更简单并且代表了最差条件。对于大部分生物技术生产，一些生产只对原料药进行回收，其他的将使用早期阶段的产品代表早期阶段的残留。

对于所有取样的表面都应建立回收值。对于擦拭和冲洗水取样，在进行所有表面的回收研究时完成。可替换的选择就是在表面上进行一个残留研究，通过记录的证据，等同于（术语是回收率）其他没有进行正式回收研究的表面。对于回收研究，这是本质的分组或者家族方法。建立分组或家族等值是基于发布的研究或内部的数据。一些公司使用的另一个方法是排除整个设备表面少于小的百分比（如 1%或 2%）取样表面组成的正式回收研究，在这样的情况下，用于排除表面的回收值是任何其他表面种类的最低回收，为此进行正式的取样回收研究或者根据公司程序要求最低可接受回收百分比。

擦拭回收研究被进行是在平方面积为25cm²或者100cm²。方案中取样生产设备中，擦拭10cm×10cm的区域并不总是可能的（必要时擦拭5cm×20cm的区域） 。此外，精确的擦拭 100cm²实际上是不可能的（可能要求 60cm²或者128cm²，由于设备特定几何结构）。在这种情况下，针对这些情况基于取样10cm×10cm应用回收百分比。如果采用这种方法，可接受表面积范围（如，实际取样区域的 25%到 150%）应该建立。但是，如果方案中设备表面的取样区域与实际有区别，样品的残留限度应基于实际的擦拭面积进行调整。

2、 擦拭回收

对于擦拭回收研究，取样片使用目标残留溶剂标记，干燥，在清洁验证方案中使用擦拭程序进行取样。在适当的溶剂中擦拭被解吸，在实际样品中测量残留的数量。回收量与取样片上标记的数量进行比较，以回收百分比的形式表示结果。因为擦拭是手工程序，每个人重复进行三次回收研究。最好是至少两个人对每个残留结合和表面种类进行擦拭回收研究。研究所建立的回收百分比可以以不同的方式定义，但是代表性的被定义为任何一个分析者的最低平均回收率。一个可接受的擦拭回收率取决于如何使用擦拭回收率。如果进行的回收率以证明取样方法不具有限度或者分析结果的修正，要求至少70%的回收率。如果回收百分比被用于修正残留限度或分析结果，要求至少50%的回收率。应建立回收百分比的上限。

3、 冲洗回收

冲洗回收研究解决了残留冲洗取样的正确性。说明了如果表面有残留，残留将被有效移除并在冲洗液中进行分析。冲洗回收研究像擦拭回收研究一样，在标有目标残留溶液的取样片上进行并允许干燥。对于擦拭取样，在清洁验证方案中使用准确的擦拭程序是必要的。对于冲洗取样，相反的，精确的冲洗程序在实验室中是不能够被复制的。但是， 在实验室中模拟冲洗程序是可以实现的。如果可能，模拟冲洗的条件应该与设备冲洗的情况相同。这包括冲洗溶剂的选择（典型的是水） ，以及冲洗溶剂的温度。在其他的情况下，应选择与设备冲洗条件相同或者最差情况的冲洗条件。比如，取样表面的溶剂比在回收研究中应与设备冲洗条件相同或者低于设备冲洗条件。

模拟冲洗过程的一种方法是在清洁的收集容器之上悬挂标记的取样片并倾倒冲洗溶液到表面至收集容器中。另一种方法是标记适当材质的烧杯底部，允许残留干燥，加入冲洗溶液至烧杯，温和搅拌一段时间，近似于最终冲洗的时间。冲洗溶液从烧杯中由移液管吸出或者倒出并进行分析。第三种选择，这种情况下使用材质的烧杯是不合适的，在烧杯底部放入标记的取样片，模拟冲洗，后续如第二种方法。

因为冲洗取样不典型的依赖于操作者，一个操作人员重复三次以确定回收百分比是充足的。可接受的回收百分比建立在擦拭回收研究同样的水平和条件下。

4、 目检中的“回收”

这个过程实际上是确定定量的“目检限度” ，在此，目检是唯一的取样/分析方法并且“目检清洁”被用作给定残留唯一可接受的标准，当对残留缺少擦拭或冲洗取样时。如果目检用来补充擦拭或者冲洗取样，则不需要确定目检限度。特定观察条件下的目检限度可通过在不同水平下（以 μg/cm²）带有残留溶液的设备表面材质标记取样片确定并且通过受训观察人员小组确定在标记表面清楚观察到残留的最低水平。这种目检限度的意义是如果设备表面被确定目检清洁在清洁验证方案中同样（或更严格）观察条件下，擦流水平是低于目检限度的。适当的观察条件包括距离，亮度和角度。目检限度取决于残留的特性以及表面的特性以及检察人员的视觉灵敏度。文献中目检限度报告的标准值是1-4μg/cm²。

5、 生物载荷和内毒素取样的回收

回收研究确定表面回收百分比是不恰当的并且对于微生物取样或者内毒素取样是不要求的，原因如下：

1.微生物检测计算的问题——“菌落形成单位”是可计数的，而个体微生物是不能计数的。

2.植物微生物将死亡或者失去生存能力当在标准取样回收程序中对取样片干燥时。

3.这个菌种用于回收研究是不清晰的。

4.微生物限度的设置显著的低于能够引起产品质量问题或工艺性能（如，SIP）的可能，因此，即使回收可能是低的（＜50%），产品质量或工艺性质不能受到影响通过排除回收因子。

5 、取样人员的培训和资质

培训包括的步骤是帮助取样人员学习取样/检查的技术。这章的目的是， “取样”和“取样人”也包括目测评估的“检查”和“检查人” 。资质确认包括证明的过程，预期的取样人员能够恰当的完成取样。

培训总是在确认资质确认前。至少，受训人员应了解取样程序并且经过培训的取样人员应说明正确的程序。在了解和说明的过程中，经过培训的取样人员对取样程序中的某些实践或细节给予合理解释。技术说明也可以使用目测指示剂在擦拭的表面上，以帮助受训者观察结果。培训的最后一步是由预期取样人员对正确的程序进行说明。

取样资质确认的过程将取决于取样的种类。资质确认只包括正确技术的说明 （也就是培训过程的最后一步） 或者， 还包括一个 “测试” ，挑战受训者正确进行活动的能力（如，使用一些取样片进行目检，包括一些是脏污的其他的不是，或者在取样片上对已知的脏污残留进行擦拭取样） 。任何一种资质确认都可以定期重复或者根据取样人员在培训情况进行重复。

1、 擦拭取样培训的关键问题

对于培训预期取样人员最好有一份单独的擦拭取样 SOP。这将避免可能出现的“程序变形” ，如果擦拭程序内容在每一个方案中重复出现。这也将有助于保证在回收研究中使用同样的取样程序，如同方案中执行的并简化培训。

擦拭培训中一致性的4个关键点：

1.湿润擦拭头的一致性

2.擦拭动作的一致性（包括重叠的笔画）

3.使用压力的一致性

4.适当表面擦拭的一致性

假设使用的正确的擦拭，擦拭的正确数量以及正确的润湿溶液，那么第五个擦拭取样的关键因素包括TOC，强调避免擦拭的外部污染，由于到处存在的有机碳。在培训擦拭取样人员时微生物取样中强调采用 “无菌技术”是有好处的，尤其是取样涉及TOC分析。相对于微生物取样中使用的无菌技术，手套上或者在取样前在邻近的表面使用异丙醇的负面结果（即，人为的提高了 TOC值）应强调。

因为擦拭取样不想人工清洁过程，更高的取决于人员的一致性， 应考虑在已建立的基础上对擦拭取样人员进行再培训和/或再确认。再培训可能包括与初始培训同样的过程，或者只包括原始培训的一部分。再确认通常包括对初始确认的重复。再培训和/或再确认的需求应作为擦拭程序变更控制的一部分进行处理并且作为补救措施，当调查不合格结果时，怀疑发生擦拭取样“操作失误” 。

2、 冲洗取样培训的关键问题

对于培训预期的取样人员最好有单独的冲洗取样SOP。对于CIP 系统，冲洗取样程序可能与水系统取样是相同的程序，适当的修正以覆盖工艺设备的取样。

冲洗取样中精确度的最大问题是避免对冲洗样品产生污染，由于取样口和取样口周围的环境。这包括充分的冲洗或者清洁取样点，在取样之前，以及避免由于在手套上使用异丙醇或者使用异丙醇清洁取样口（在取样之前）而对样品产生污染。正如在擦拭取样培训中，在培训冲洗取样人员过程中强调微生物取样中使用“无菌技术”是有好处的，尤其取样涉及TOC 分析。在培训冲洗水取样人员从CIP 循环系统的最终冲洗水取样时，取样的时间是至关重要的。一般的是冲洗水的最后一部分用来取样，但是，如果取样能够代表最差条件，在此之前进行取样也是可接受的。然而，一旦冲洗过程完成，就没有办法返回和收集冲洗水样品。（除非进行一个单独的冲洗水取样）

由于冲洗水取样的一致性较少的依赖于操作人员，再培训和再确认的需求作为冲洗水取样程序变更控制的一部分进行处理，并在不合格结果调查中疑似取样操作失误时进行。

3、 目检培训

目检的培训取决于目检是否作为执行程序的一部分或者目检是否是实验室“检测限度”的决定。在任何一种情况下，最好有目检的SOP，以便根据SOP 进行培训。任何目检的检察人员都应有适当的视力测试。

执行方案中关于目检人员的培训，关键点是：

1.进入地点查看

2.适当的光源

3.识别表面残留和表面缺陷之间差异的能力

目检培训的一个重要元素是知道什么时候要求进一步的分析以确定残留的性质。比如，如果设备上发现变红，应注意残留的存在。确定是否是残留导致清洁过程失败是一个单独的决定。实验室“检测限度”确定的目检程序通常与执行方案中的目检不同，因为目的是不同的。目的决定了在什么水平上某一种残留能够始终被观察到跨过标记的表面以关联已知残留水平的目检检测限度低于标记水平。这个程序可以在单独的 SOP 中，或者整合到目检的 SOP中。除了包括在执行方案培训中的相同元素外，这个程序中培训的关键，涉及观察标记的取样片，是仔细区别目测清洁的表面，部分脏污的表面（标记区域的一部分有明显的残留）以及完全脏污的表面。