摘 要： 采用紫外标准曲线法测定对乙酰氨基酚片含量，评估测定结果的不确定度。通过不确定度来源分析，建立数学模型，量化不确定度分量，计算出测定值的不确定度结果及各分量的贡献率。不确定度的主要来源为系列标准溶液的配制及样品处理过程，其次为紫外仪器和标准工作溶液的配制。当k=2时，按置信区间为95%，对乙酰氨基酚片百分标示量含量测定值为（99.55±2.48）%。不确定度评估可以用于分析和优化紫外标准曲线法测定药品含量的过程，对药品的质量控制和方法改进有重要的指导意义。

关键词： 紫外； 标准曲线法； 对乙酰氨酚片； 含量测定； 不确定度

 

对乙酰氨基酚片是一种常见的解热镇痛药，临床上应用非常广泛[1]。对其进行含量测定是片剂质量控制的重要手段，从而保证临床用药剂量的准确性。对乙酰氨基酚的含量测定方法有紫外可见分光光度法、高效液相色谱法、近红外光谱法等[2‒4]。紫外可见分光光度法操作简单、方便，分析成本低，更易普及。《中华人民共和国药典》（2020年版）采用UV吸收系数法，按C8H9NO2的吸收系数图片715计算片剂含量，目前尚未报道采用紫外标准曲线法测定对乙酰氨基酚片含量。由于实际测定中受多种因素影响，吸收系数可能会有偏差，参考2023年全国职业院校技能大赛“ZZ012食品药品检验赛项规程”建立了UV标准曲线法测定对乙酰氨基酚片含量[5]。为减少测量误差使测定结果准确性更加可靠，根据JJF 1059.1—2012 《测量不确定度评定与表示》和JJG 196—2006 《常用玻璃量器检定规程》要求，参考相关文献[6‒11]，同步进行了含量测定不确定度的分析，为提高对乙酰氨基酚片含量测定方法和结果的可靠性和准确性提供科学依据。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

紫外分光光度计：UV-1800PC-DS2型，上海美普达仪器有限公司。

电子天平：ME204E型，感量为0.000 1 g，瑞士梅特勒-托利多公司。

吸量管：5、10 mL，均为A级，德国普兰德公司。

容量瓶：100、250 mL，均为A级，德国普兰德公司。

对乙酰氨基酚对照品：质量分数为99.9%，批号为23120437，坛墨质检标准物质中心。

对乙酰氨基酚片：规格为0.3 g/片，批号为221204，山西汾河制药有限公司。

氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水：纯净水（满足实验用水一级水），杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

乙酰氨基酚标准溶液：0.1 mg/mL，取对乙酰氨基酚对照品0.25 g，精密称定，加0.4%氢氧化钠溶液50 mL溶解，转移至250 mL量瓶中，加水稀释定容，摇匀，作为标准储备液；精密量取10 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀释定容，摇匀。

对乙酰氨基酚系列标准工作溶液：精密量取0.1 mg/mL对乙酰氨基酚标准溶液0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分别置于7只100 mL容量瓶中，分别加入0.4%氢氧化钠溶液10 mL，用水稀释至标线，摇匀，质量浓度分别为0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 μg/mL。

1.2.2 样品处理

取对乙酰氨基酚片20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于对乙酰氨基酚40 mg），置于250 mL量瓶中，加入0.4%氢氧化钠溶液50 mL与水50 mL，振摇15 min，用水稀释至标线，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置于100 mL量瓶中，加入0.4%氢氧化钠溶液10 mL，用水稀释至标线，摇匀。

1.2.3 测定方法

（1）标准工作曲线的建立。于257 nm波长处测定系列标准工作溶液的吸光度。以质量浓度为横坐标、对应的吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。

（2）样品含量测定。取供试品溶液，于257 nm的波长处测定吸光度，由测得吸光度从标准工作曲线查出目标溶液中对乙酰氨基酚的浓度，计算对乙酰氨基酚片百分标示量（质量分数）。

1.2.4 数学模型

对乙酰氨基酚片标示百分含量（质量分数）按式（1）计算：

 

(1)

式中：——质量分数，%；

ρx——样品溶液对乙酰氨酚质量浓度，g/mL；

V1——样品初次定容体积，mL；

V2——样品稀释时移液管移取体积，mL；

V3——样品最后稀释定容体积，mL；

mx——样品片粉的称取质量，g；

——样品平均片重，g/片；

ms——样品标示质量，0.3 g/片。

 

2、 测量不确定度来源

 

根据1.2.4建立的数学模型和测量过程分析，紫外标准曲线法测定对乙酰氨基酚片含量的不确定度来源包括：

（1）标准工作溶液配制引入的不确定度urel(S1 )；

（2）系列标准溶液配制引入的不确定度urel(S2)；

（3）平均片重引入的不确定度urel( )；

（4）样品处理引入的不确定度urel(X )；

（5）紫外仪吸光度示值引入的不确定度urel(I )；

（6）标准曲线拟合引入的不确定度urel(L )；

（7）重复性测量引入的不确定度urel(R )。

 

3、 不确定度分量的评定

 

3.1 标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel (S1)

3.1.1 对照品纯度引入的相对标准不确定度urel (P)

对乙酰氨基酚对照品物质证书显示其质量分数为99.9%，扩展不确定度Us=0.5%，ks=2，则对照品纯度引入的标准不确定度：

按照矩形分布，k=，则对照品纯度引入的相对标准不确定度：

urel(P) =

3.1.2 对照品称量引入的相对标准不确定度urel(mr)

选用感量为0.1 mg的天平称量对乙酰氨基酚对照品，所得称量值为0.250 9 g。依据天平说明书参数，该天平的最大允许误差为±0.5 mg，按照均匀分布，k=，则称量引入的标准不确定度：

u (mr)=

采用减重法称量对照品，经过2次称量，因此对照品称量引入的相对标准不确定度：

urel (mr)=

3.1.3 对照品稀释定容体积引入的相对不确定度urel(Vs1)

标准工作溶液稀释定容包括250 mL容量瓶初始定容、10 mL分度吸量管移液和100 mL容量瓶稀释定容带来的相对不确定度，主要由体积校准和温度变化两方面引入。根据JJG 196—2006 《常用玻璃量器检定规程》规定的相应容量瓶和吸量管的最大允许误差，已知水的平均体积膨胀系数为2.04×，可认为溶液的体积膨胀系数与其相接近，高硼硅玻璃的膨胀系数约3.3×，相对于水的膨胀系数，可忽略不计[12‒13]。设实验室的温度在±5 ℃范围内变化。刻度吸量管、容量瓶和温度变化引入的定量偏差均视为矩形分布k=，标准工作溶液稀释定容体积引入的相对标准不确定度分量见表1。

表1   标准工作溶液稀释定容体积引入的相对标准不确定度分量

Tab. 1   Relative standard uncertainty components introduced by dilution volume of standard working solution

 

 

根据表1中各分量，合成得标准工作溶液稀释定容体积引入的相对标准不确定度：

urel(Vs1)==3.14×

将urel (P)、urel (mr)、urel (Vs1)三项合成，得对乙酰氨基酚标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度：

urel(S1)==3.82×

3.2 系列标准溶液配制引入的相对标准不确定度urel(S2)

已知水体积膨胀系数，设实验室的温度在±5 ℃范围内变化。刻度吸量管、容量瓶和温度变化引入的定量偏差均视为矩形分布，k=，移液和定容部分分量值同表1。由对乙酰氨基标准工作溶液制备系列标准溶液，需选用10 mL刻度吸管移取标准工作溶液移液6次，100 mL容量瓶定容7次，合成得系列标准溶液配制引入的相对标准不确定度：

urel (S2)==7.55×

3.3 平均片重引入的相对标准不确定度urel()

取对乙酰氨基酚片20片，使用感量为0.1 mg的天平称量总重，依据3.1.2，天平称量的标准不确定度：

u1()=

按照2020年版《中华人民共和国药典》四部通则中重量差异检查法，精密称定每片质量，计算得平均片重为346.4 mg，标准偏差s =3.54 mg，则药品平均片重引入的标准不确定度[14]：

u2 ()==0.79 mg

由平均片重引入的合成相对标准不确定度：

uc ()==0.84 mg

由平均片重引入的相对标准不确定度：

urel()=

3.4 样品处理引入的相对标准不确定度urel(X)

3.4.1 样品片粉称量引入的相对标准不确定度urel(mx)

使用感量为0.1 mg的天平称量片粉，所得称量值mx=44.6 mg，依据3.1.2，天平称量引入的标准不确定度：

u(mx)=

则片粉称量引入的相对标准不确定度：

urel(mx)=

3.4.2 样品溶液稀释定容体积引入的相对标准不确定度urel(Vx)

样品溶液稀释定容引入的不确定度包括250 mL容量瓶初始定容、5 mL分度吸管移液和100 mL容量瓶稀释定容引入的不确定度，依据3.1.3，5 mL刻度吸量管校准引入的标准不确定度：

=1.44 mL

温度变化引入的标准不确定度：

mL

合成5 mL刻度吸量管引入的相对标准不确定度：

urel(V5)=2.94

合成样品溶液稀释定容体积引入的相对标准不确定度：

urel(Vx)==3.13×

将样品称量和稀释定容引入的相对标准不确定度合成，即得样品处理引入的相对标准不确定度：

urel (X)==7.21×

3.5 紫外仪吸光度示值的相对标准不确定度urel(I)

测量吸光度引起的不确定度主要由UV计透射比允许误差引起，采用B类评定[15]。校准证书得知UV计的透射比示值（T）误差为0.30%，已知A=lgT=0.542 5，则T=0.286 7，T的相对误差为0.30%，即T=0.286 7±0.003，T∈(0.283 7，0.289 7)，计算可得A∈(0.538 1，0.547 1)，分布半宽=（0.547 1-0.538 1）/2=0.004 5，按矩形分布计算，取k=，则其标准不确定度：0.004 5/k=2.60×，相对标准不确定度：

urel(I)=4.79×

3.6 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel (L)

在257 nm处测定对乙酰氨基酚系列标准工作溶液，每个质量浓度点测定3次，共21次，系列标准工作溶液吸光度结果见表2。

表2   系列标准工作溶液吸光度

Tab. 2   Absorbance of series standard working solution

以质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，采用最小二乘法拟合，即得线性回归方程y=ax+b。其中斜率a=0.070 575，截距b=0.001 707，线性相关系数r=0.999 9。

回归曲线的剩余标准差：

S(A)=

对供试品溶液测量3次，平均吸光度为0.542 5，代入回归方程计算得平均质量浓度为ρ0=7.710 6 μg/mL。

标准曲线拟合引入的不确定度：

u(L)=

式中：p——每份样品溶液平行测量次数，p=3；

n——系列标准工作溶液重复测定次数，n=21；

——系列标准工作溶液质量浓度的平均值，图片=4.441 9 μg/mL；

计算得到标准曲线拟合过程引入的不确定度：

u (L)=1.12× μg/mL

相对标准不确定度：

urel(L)=

3.7 重复性测量引入的相对标准不确定度urel (R)

对供试品进行6次独立重复试验，测量均值的标准不确定度u(R)=/，其相对标准不确定度urel(R)=u(R)/，结果数据见表3。

表3   测量重复性引入的不确定度

Tab. 3   Uncertainty introduced by repeatability

 

3.8 合成、扩展与报告不确定度的计算

综上可知，所建方法引入的相对标准不确定度urel(w)由标准工作溶液配制、系列标准曲线溶液配制、平均片重、样品处理、紫外仪器、标准曲线拟合和重复性试验产生的相对标准不确定度分量合成得：urel(w)=1.25。

样品中对乙酰氨基酚片含量最终测定结果X为99.55%，由此得到合成标准不确定度：

u= urel(w)×X=1.24%

取置信水平为95%，包含因子k=2，则扩展不确定度U=u×k=2.48%。

紫外标准曲线法测定对乙酰氨基酚片含量测定结果可表示为（99.55±2.48）%，k=2。

3.9 不确定度贡献率的计算

各相对标准不确定度分量及贡献率统计结果[16]见表4。

表4   各不确定度分量计算结果及贡献率

Tab. 4   Calculation results and contribution rate of each component uncertainty

 

 

 

4、 结论

 

结合不确定度评定结果和不确定度贡献率分析可知，该方法测量不确定度主要来源于系列标准工作溶液配制和样品处理过程，其次为紫外仪器和标准工作溶液配制，因此在实验过程中，应选择最大允差较小的A级移液管和容量瓶，定期校准维护天平和紫外仪器，同时需要实验人员严格按照操作规程，熟练规范操作，从而减小分析结果的不确定度，提高结果的准确度。

样品片粉需称取质量约40 mg，而该方法采用感量为0.000 1 g的天平，可能导致相对标准不确定度的放大。在实际工作过程中，有条件的可以选择精度更高（感量为0.000 01 g）的天平，从而减小称量引入的不确定度。若采用感量为0.000 01 g的天平，可以将对照品的称取质量缩小至25 mg，同时只需采用250 mL量瓶直接溶解不需要再进行稀释，从而节约试剂同时可降低不确定度。

通过分析比较各不确定度分量的大小，可发现对检测结果影响较大的环节，进而重点控制该环节的不确定度来源，从而为进一步提高分析结果的准确性提供依据。同时引入测量不确定度后，检测结果不再是单一数值，而变为被测值可能分布的区间范围，由“检测值±扩展不确定度（U）”表示，可避免碰到检测值处于限值边缘附近时的误判，从而有效提高检验结论的科学性和可靠性[17]。

 

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引用本文： 陈月琴，马明，唐利宇，等 . 紫外标准曲线法测定对乙酰氨基酚片的不确定度评定［J］. 化学分析计量，2024，33（8）：118. (CHEN Yueqin, MA Ming, TANG Liyu, et al. uncertainty evaluation of content determination of acetaminophen tablets by UV standard curve method[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(8): 118.)