EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）染色是一种新型的细胞增殖检测方法，用于标记和检测处于DNA合成期（S期）的细胞，以反映细胞的增殖情况。

一、原理

EdU是一种胸苷类似物，能够在细胞的S期被掺入到正在合成的DNA链中，取代天然的胸腺嘧啶脱氧核苷（Thymidine）。这意味着EdU只能在细胞正在进行DNA复制（即处于S期）时被掺入细胞的DNA中，因此，EdU的掺入标志着细胞正在增殖。一旦EdU被掺入到DNA中，通过一种称为“点击化学”（Click Chemistry）的铜催化叠氮-炔反应，可以将荧光标记的叠氮物与EdU中的炔基共价结合。

这种反应高效、快速，并且在细胞内的非损伤环境下进行。反应后，DNA中的EdU就会带有荧光标记，能够在荧光显微镜或流式细胞仪下检测到。通过荧光显微镜或流式细胞仪，研究者可以定量测定EdU掺入量，从而评估细胞增殖情况。荧光强度与细胞内EdU掺入的多少成正比，因此反映了细胞增殖的活跃程度。

二、优势

1）高灵敏度：能够检测到少量处于增殖状态的细胞，对于研究细胞早期增殖或低增殖率的细胞群体具有优势。

2）简单快捷：实验操作相对简便，染色过程耗时较短，与传统方法（如Brdu掺入法）相比，不需要复杂的DNA变性等步骤。

3）兼容性好：可以与其他细胞标记技术或染色方法联合使用，例如可同时进行免疫荧光染色，以进一步了解增殖细胞的特定表型或蛋白表达情况。

4）对细胞损伤小：由于EdU染料分子较小，在细胞内更容易扩散，且无需严苛的样品变性处理，可有效避免对细胞造成损伤，有助于在组织、器官的整体水平上更真实地观测细胞增殖情况。

三、步骤

1、细胞培养与处理（贴壁细胞为例）

将细胞接种在合适的培养板或培养皿中，一般取对数生长期细胞，重悬至2×105个/mL，将100μL细胞悬液加入每孔（96孔板），放置37ºC恒温培养箱中孵育过夜；根据实验需求进行相应的处理和刺激，使其正常生长至所需密度。

2、EdU掺入

将EdU稀释至20µM，每孔加入100µL EdU工作液，使浓度为10µM，继续37℃孵育2h，确保EdU充分掺入到新合成的DNA中。弃培养基，用PBS洗涤1~2次。

3、细胞固定与通透

1）固定：每孔加入50μL 4%多聚甲醛固定细胞30min，以保持细胞的形态和结构。

2）通透：对于某些细胞类型或实验要求，可能需要进行通透处理，以增加细胞膜的通透性，使后续的染色试剂能够更好地进入细胞内。常用的通透剂为含0.5% Triton X-100的PBS，孵育时间一般为10-20min。但如果实验仅需检测细胞表面的EdU标记，可不进行通透处理。

4、染色反应

每孔加入50µL反应液，在室温避光孵育30min，以使荧光染料与EdU充分结合。

细胞核染色（可选）：为了更好地观察细胞形态和定位，可使用DAPI等细胞核染料对细胞核进行染色。避光孵育5-10min。

5、图像采集与计数：使用荧光显微镜或共聚焦显微镜采集图像，并进行细胞增殖的定量分析。通过计数EdU阳性细胞的数量或测量荧光强度等指标，来评估细胞的增殖情况。

四、注意事项

1）不同细胞类型对EdU的摄取和掺入效率可能不同，因此需要通过预实验确定合适的EdU浓度和孵育时间，以保证检测的准确性和灵敏度，同时避免因EdU浓度过高或孵育时间过长对细胞产生毒性影响。

2）在染色和核染色步骤中需要避免光照，以免影响染色效果。

3）在铺板时确保细胞分布均匀，避免细胞过密或过稀，否则会使信号不均匀或局部过强。

如图为不同处理下MDA-MB-468和MDA-MB-436细胞的增殖能力。

参考资料：

Dong F, Ruan S, Wang J, Xia Y, Le K, Xiao X, Hu T, Wang Q. M2 macrophage-induced lncRNA PCAT6 facilitates tumorigenesis and angiogenesis of triple-negative breast cancer through modulation of VEGFR2. Cell Death Dis. 2020 Sep 9;11(9):728. doi: 10.1038/s41419-020-02926-8. Erratum in: Cell Death Dis. 2022 Aug 30;13(8):752. doi: 10.1038/s41419-022-05203-y. PMID: 32908134; PMCID: PMC7481779.

Zhang Q, Yang L, Liu YH, Wilkinson JE, Krainer AR. Antisense oligonucleotide therapy for H3.3K27M diffuse midline glioma. Sci Transl Med. 2023 Apr 12;15(691):eadd8280. doi: 10.1126/scitranslmed.add8280. Epub 2023 Apr 12. PMID: 37043556; PMCID: PMC10263181.

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