在进行清洁验证时，我们通常需要确定一系列限度，这些限度包括对活性蛋白或其他主要物质成分的分析、清洁剂的分析、生物负载水平的分析、内毒素水平的分析，以及对设备进行目视检查以确保其清洁。如果存在任何与活性蛋白或其他工艺组分相关的特殊毒性物质，如细胞毒性、变应原性或生殖危害物，生产商的毒理学或生理学团队必须评估是否需要调整这些限度，或者是否需要使用专用设备以确保安全。

在讨论这些限度时，我们应考虑自然残留物以及生产过程的不同阶段，比如原液生产与配制/分装阶段。原液生产阶段包括所有旨在获取活性药物的步骤，而配制/分装阶段则涉及将原液加入到成品制剂中，并进行药品物质的初级包装。原液生产过程可以进一步细分为上游生产步骤，即在药物收获前的所有步骤，以及下游生产步骤，包括药物的纯化和后续步骤。这些阶段的考虑对于确保清洁验证的限度既科学又实用至关重要。

1，活性物限度的关键问题

在生物技术领域，清洁过程可能会导致活性分子，尤其是蛋白质，发生结构改变和降解。以下是蛋白质降解的主要机制：

①在碱性溶液中，尤其是在高温条件下，含有氢氧化钠或氢氧化钾的溶液会使蛋白质水解成可溶的寡聚物或自由氨基酸。

② 酯基团的水解，例如皂化反应，将脂肪和油脂转化为甘油和脂肪酸。

③ 次氯酸钠作为一种清洁剂，能有效去除变性蛋白质残留。它是一种强氧化剂，能使蛋白质降解成更小的片段。使用时需注意其对不锈钢的潜在危害，并确保漂洗循环能彻底清除氯离子残留。

④ 在高pH值环境下，蛋白质水解受时间和温度的显著影响，pH值和温度越高，水解越容易发生。

蛋白质降解后的小片段更易溶于水，更容易通过清洁和漂洗过程从设备表面去除。此外，高pH值环境下的蛋白质水解可能导致其生物活性不可逆地显著下降。

在实验室中，可以通过将活性物质暴露在模拟清洁条件下的清洁溶液中，然后对生成的混合物进行分析和生物化学测试来验证活性物的降解。

由于活性物质的降解，生物技术制造商在清洁验证流程中通常不直接设置活性限度或检测活性。清洁过程完成后，理论上不应有活性物质残留。因此，通常使用总有机碳（TOC）等非特异性分析方法来检测蛋白质残留或片段。需要注意的是，清洁后的真正蛋白质残留非常低，因为TOC检测的是所有有机碳源，而不仅仅是活性蛋白的残余。

在制剂和最终分装中，蛋白质活性限度的设定通常基于污染量计算（MAC或最大可允许的传递量），与小分子清洁验证使用同样的方法。如果清洁方法导致活性蛋白降解为小分子片段，该方法代表了最差情况。对于长期使用的产品，一个典型的方法是允许随后制造的最大活性日治疗剂量的产品中携带不超过最小活性日治疗剂量的1/1000。此外，如果计算允许在随后的药物产品中活性蛋白残留量超过10ppm，可以使用10 ppm活性药物蛋白的限度。单位面积的限度可以基于下一个最小批量的药物生产所共用的设备面积上计算出来。

在原液生产中，制剂/分装的污染量计算通常不适用，因为如果污染量计算基于整个生产线的设备表面积，限度会非常低，除非药物活性成分在清洁过程中不会降解，否则无法用现行分析技术测量。活性物的残留通常通过TOC等间接测量方法来检测。通常清洁验证TOC的定量限度大约为100-500 ppb碳，与含碳量为50%的约200-1000 ppb蛋白质的数值等效。

另一种建立活性物限度的方法是基于毒理学计算，这涉及到活性物质短期的毒理学数据，最终得出允许的日摄入量（ADI）。如果数据是基于口服的毒理学，对注射药的清洁应增加安全系数。这种基于安全考虑的计算通常会导致较高的限度。如果活性蛋白降解，相关的毒理学数据更可能是降解碎片的毒理学，而不是天然蛋白质的毒理学，通常认为后者安全问题更少。

2，清洁剂的限度

在生物制药生产中，清洁剂的限度取决于不同的生产阶段，如制剂/分装和原液生产。一个典型的清洁程序可能包括使用强碱性清洁剂，随后是磷酸盐清洁剂，或者先是碱性清洁剂后是酸性清洁剂，这些步骤都是分开进行的。

① 市售化学试剂的限度：如果清洁过程中仅使用了市售化学试剂，如氢氧化钠和磷酸，通常会基于电导率值来设定间接的限度。更精确的方法是，基于毒理学污染量计算或工艺参数效果来确定氢氧化钠或磷酸的可接受水平，并将电导率限度设定在特定温度下的相应浓度。这个限度通常比相同温度下的注射用水的电导率限度要严格，例如设定为5 μS/cm。这是因为这个限度比科学计算的限定值更严格。此外，由于磷离子或钠离子可能是后续产品的成分，少量的污染并不明显。需要注意的是，市售化学试剂的毒性计算是基于极端情况，因为这些化学物质不会以其原始形式污染最终产品。如果这些化学物质高浓度污染，工艺检查（如pH的显著变化）会发现这种不符合性。因此，目标是确认清洁剂含量非常低，而不是要求与注射用水的标准一致。允许电导率限度略高于注射用水的原因是，一旦水从循环管路中取出并通过清洁设备，就不应期望它一定满足WFI的电导率限度。

②处方清洁剂的限度：对于制剂/分装制造，处方清洁剂（可能包含无机氢氧化物和多种有机组分）残留量的限度通常基于其短期毒性（LD50）数据来计算污染量。这种毒性资料可以由清洁剂制造商提供，或基于处方成分分析的最坏情况假设来计算。如果处方清洁剂的默认值比污染量计算的值更严格，也可以采用。处方清洁剂的默认值一般为10ppm。活性物污染量计算与处方清洁剂污染量计算的不同之处在于，它们对后续产品的污染限度计算方法不同，一个使用的是剂量比率，而另一个用的是半致死率LD50比率。一旦完成计算，随后的清洁剂限度计算使用与活性物同样的公式，来确定每个拭子或每个分析样品的限度。

对于原液生产，适用于活性物限度的一些问题也同样适用于清洁剂。也就是说，考虑到整个共享面积的污染量计算值通常非常低，难以测量。但是，使用的处方洗涤剂通常在分离提纯过程中可以根据分子量去除（例如通过超滤或分子排阻色谱法）。与活性成分的限度一样，毒性计算可能适用于下游纯化后的步骤或下游工艺的最后一个容器。

3，微生物限度

在考虑清洁后微生物限度时，重要的是要认识到清洁过程本身并不会使设备达到无菌状态。即便设备将在位灭菌或在下一产品生产前进行灭菌，通常的做法是评估微生物负载，以确保后续的生产工艺不会受到过度的微生物挑战。一般来说，达到非无菌生产环境下的微生物限度标准（即每平方厘米表面取样1-2CFU）就已经足够。

对于冲洗取样，不同公司可能会采用不同的微生物限度标准。一些公司可能会采用典型的注射用水标准（WFI值，即每100毫升水中10 CFU），而其他公司可能会采用每100毫升水中100 CFU或1,000 CFU的标准。设定较高限度的原因是设备随后将进行灭菌处理，因此允许有更高的微生物限度。

此外，需要注意的是，WFI值是在管路中循环的注射用水的标准。一旦这些水从循环管路中取出并加入到设备中，就不应期望其微生物限度必然符合原有的注射用水标准。这是因为在转移过程中，水可能会从空气中吸收微生物，导致微生物含量增加。因此，在设定微生物限度时，需要考虑到这些因素，以确保生产环境的安全性和产品的质量问题。

4，内毒素限度

内毒素的污染问题在产品最终阶段尤为关键，因此对最终产品的内毒素污染量需要特别关注。在这一过程中，内毒素的测定通常在最终的冲洗水中进行，其限度一般设定为符合注射用水的标准，即0.25EU/ml。

在细胞培养过程中，内毒素去除步骤之前的冲洗水取样应达到注射用水的限度。然而，对于使用大肠杆菌这类革兰氏阴性细菌进行的细菌发酵过程，由于这些细菌在冲洗过程中可能产生大量内毒素，因此在发酵和收获步骤之后的清洗中达到注射用水限度是不现实的。在这种情况下，一些公司会设定一个更高的内毒素限度，如5至25 EU/mL。

达到这一更高的限度水平表明清洁工艺是受控的，而且任何在这一水平上的潜在污染都应在随后的内毒素清除步骤中进行评估。这样的做法确保了即使在难以完全清除内毒素的发酵过程中，最终产品的质量也能得到保障。

5，视觉清洁标准

外观目测是验证残留物去除效果的一种直接方法。虽然它不是一种定量手段，但对于检查产品表面的清洁状况非常有用。只要能够接触到关键表面，外观目测就很容易执行，它可以确认生产设备重要区域的清洁程度。根据文献，少量的残留物如果存在，通常是可见并可被察觉的。在生物制药领域，目测清洁标准通常作为清洁验证方案的一部分，用于测试擦拭和/或冲洗液中的残留物。这种方法有助于确保生产设备在关键区域的清洁度达到预期标准。

6，修改限度

作为日常工艺验证监测的一部分，应设立行动限度和警戒限度。这些限度通常比验证方案中设定的合格/失败限度更为严格。通过观察工艺能力的连续低水平表现以及维持这些水平的能力，可以进行风险评估。基于这样的评估，可以考虑在未来的验证方案中采用更严格的限度标准。这种做法有助于确保工艺的持续稳定性和产品质量的高标准。