前言

一个分析方法用于临床常规检验之前,进行条件优化和性能验证是必需的。如果实验室自建的LC-MS/MS方法要应用于临床诊断,需要在方法开发过程中对所有的分析步骤如质谱条件、色谱条件和样品处理条件等进行优化,确保建立的方法可以检测目标分析物。为了保证检测结果的准确可靠,证明分析方法的性能符合临床检验的目的和要求,必须对开发的方法进行严格而全面的方法验证。

确定目标分析物

在计划开发一个 LC-MS/MS方法时，首先要掌握目标分析物的特性，包括目标分析物的理化性质、预期浓度、生物样本类型(血清、血浆、尿样、全血)、目标分析物的形式(游离型还是结合型)、是否有代谢物、是否存在同分异构体、分析方法的临床用途(诊断、筛查、预后)、是否有其他分析方法等信息。

文献检索

如果对于目标分析物不太熟悉,则需检索收集目标分析物的检测方法,特别是LC-MS/MS方法的文献报道，将已有的方法作为方法开发的起始点。对于已经报道的分析方法,需要关注的信息有:

①质谱条件,所使用的质谱类型、离子化方式、离子检测通道以及质谱参数；

②液相条件，色谱柱类型、流动相组成、洗脱方式；

③样品处理条件：样品类型、样品量、处理方法。对于一些特殊的信息如稳定性、同分异构体、干扰都需要重点关注,在方法开发过程中详细考察。

优化质谱方法

临床检验用途的 LC-MS/MS方法大部分为靶向定量方法，即对已知分析物进行定量检测，通常采用多反应监测(MRM)或者选择性反应监测(SRM)进行分析。质谱方法优化的第一步是配制纯标准溶液,进行质谱扫描。根据目标分析物的极性大小选择ESI或者APCI离子化方式,其中ESI比较合适于中等偏大极性化合物,APCI适合极性小到中等的化合物。根据目标分析物的功能基团确定离子极性(正负离子),MS/MS是实现分析方法特异和灵敏的重要保证，但前提是进行合适的离子选择，即挑选质谱响应高、选择性好的碎片离子。最好选择两个以上的离子通道(ion transition),分别作为定量和定性离子通道(quantifier and qualifier)，应尽量避免选择一些非特异的离子通道(如脱水)。离子通道确定后,必须优化离子源参数和离子通道参数。在日常的LC-MS/MS分析中,应密切监视定量离子通道和定性离子通道的信号比值,所有的样本中的比值应当保持一致。如果发现有比值差异特别大的结果,需仔细分析差异来源,排除可能的干扰。对于某些稳定差、离子化效率低、不易碎裂、浓度很低的分析物，采用衍生化方法可能是较好的选择。

基质效应是基质中某些成分的存在导致质谱离子化效率显著改变，可引起 LC - MS/MS结果产生偏差，是LC-MS/MS方法开发必须考察的因素。可通过下列方法判断基质效应是否存在：

①采用空白基质提取后加入与纯溶剂浓度相同的分析物，比较两者的信号差别；

②柱后流动注射法，发现存在基质效应特别是离子抑制时，可通过：1改进色谱，使分析物避开在离子抑制时间出峰；②改进样品处理方法，使样品更加干净；

③采用同位素内标，抵消离子抑制对分析物定量的影响；

④其他方法包括减少进样量，稀释样品，降低液相流速，用挥发性酸替代三氟乙酸、改变离子化方法(从ESI换成APCI)等也可减轻基质效应。

还有一种与质谱检测相关的不利因素为交叉干扰（cross-talk），又叫记忆效应，多反应监测(MRM)时,如果两个离子通道的碎片离子相同(或类似,相差一两个分子量单位),前一个离子通道扫描结束后,碰撞室里的离子来不及清除,会影响下一个离子通道的定量(如果色谱完全分离则无此影响)。

消除交叉干扰的办法:

1选择特异的碎片离子(特别是用稳定同位素内标时);

2避免同时检测过多的离子通道,增加离子通道之间扫描时间间隔(100~300 ms);

3改变离子通道的顺序或者设置额外的无用的离子通道(dummy MRM)。

优化色谱方法

早期LC-MS/MS用于生物分析或者临床检验时，许多人认为串联质谱仪具有绝对的选择性,样本制备和色谱分离显得无关紧要。直到发现基质效应、同分异构体和源内裂解对分析结果影响很大,才意识到色谱分离的重要性。开发良好的LC-MS/MS方法需要考虑流动相、色谱柱、洗脱方式等色谱条件的优化，而这些色谱条件的选择优化依据为目标分析物的理化特征和分析所需达到的目的。流动相最好选择符合分析要求的溶剂如LC-MS级水、HPLC级溶剂(纯度>99.9%),用挥发性添加剂如甲(乙)酸、甲(乙)酸铵、氨水、三氟乙酸等,尽量不要用不挥发性碱、盐(如硫酸盐、磷酸盐等),以免影响离子化效率,损伤

质谱仪。色谱柱的选择根据分析物的酸碱性质、极性大小,可选用非极性固定相C18、C8、C4、苯基等,或极性固定相氰基、硅胶、氨基等填料类型。另外还要考虑洗脱方式的优化,采用等度洗脱还是梯度洗脱,起始的溶剂比例,运行时间,色谱柱温度,进样体积,样品溶剂等因素对分析效率和分析结果的影响。对于一个成功的 LC-MS/MS方法而言，良好的色谱保留和色谱分离必不可少。增加色谱保留，改善分辨率就是优化上述几个色谱条件的过程,可通过增加色谱柱的长度、改变流动相的组成（添加剂比例、pH)、减少起始有机相比例、减缓梯度、降低流速、提高柱温等方法实现。

近年来，由于 LC-MS/MS在临床检验领域应用越来越广泛，许多检验项目逐渐转移到LC-MS/MS平台,样本量越来越大,因此对检测通量的要求也越来越高。采用<2μm填料的固定相,使得色谱分离可以在非常短的时间内实现,使色谱峰非常尖锐。但同时需要配置比较高端的质谱仪采集足够的数据点（>10~15 个采集点），实现快速检测。另外还需要注意有效的样本处理以净化生物样本,避免样本中残留颗粒堵塞管路,降低色谱柱寿命。色谱优化还需要注意的一个问题就是对同分异构体的分离，由于质谱仪对于同分异构体几乎没有分辨能力，因此确保色谱分离是实现这些化合物准确定量的前提。

LC-MS/MS分析检测的先进性就是采用内标法，内标可以校正样品在提取、分离、离子化等过程中的损失，获得准确可靠的结果。选择合适的内标对于分析方法的性能有着举足轻重的影响。如有可能，推荐采用同位素标记物(2H，13C，15N)作为内标，因为同位素内标几乎与目标分析物性质相同，仅在质量数上有差异，可以被质谱仪所区分。同位素内标对基质效应校正有很好的效果，因此采用同位素内标的方法更容易获得准确、稳定、可重复的结果。对于氘标记(2H)的内标，标记的位置最好在苯环或者骨架上，同时要注意潜在的氢/氘交换的不利影响。建议内标的质量数比分析物相差3以上。

优化前处理方法

临床样品常见的有血清、血浆、尿样、全血等种类,其特点是:

1、太脏,样品中含有其他组分干扰分析测定;

2、太稀,样品中待测物浓度太低,无法检测到;

3、生物样品与LC-MS/MS分析系统不兼容,如不处理可能损害分析系统。

LC-MS/MS方法的失败常常是由于样品预处理不当,导致样品信号的抑制或者共存物的干扰。测定之前进行分离、纯化、浓缩是十分重要的。

生物样品预处理的目的在于：

1、净化样品，去除干扰成分(盐、蛋白、磷脂);

2、提高灵敏度(浓缩样品、提高质谱检测信号);

3、保护进样系统和色谱柱;4优化色谱分析过程，提高通量。

常用的样品处理方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法，另外还有超滤、稀释、衍生、水解、免疫亲和等样本处理方法,根据分析目标和样本属性进行合理选择。