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以荧光中和实验(FNA)为例测定中和抗体效价

嘉峪检测网        2024-11-13 08:59

中和抗体效价测定通常使用病毒中和试验(Neutralization Assay)来评估抗体对特定病毒的中和能力,常见的方法包括传统的病毒中和实验(Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT)、基于细胞病变的中和实验(Cytopathic Effect Neutralization Assay, CPE assay)以及荧光中和实验(Fluorescent Neutralization Assay, FNA)。以下是一般的实验流程,以FNA为例:

 

 

一、实验材料准备

 

1.细胞株:选择合适的宿主细胞,接种到48孔板中,培养至汇合度约为60%。

 

2.病毒:准备实验使用的病毒株,确定感染剂量(通常使用已知TCID50的病毒)。

 

3.抗体:实验组为待测血清或抗体溶液,阴性对照组为无抗体的培养基或溶液。

 

4.培养基:含有适当血清浓度的DMEM或MEM。

 

二、血清/抗体稀释

 

将待测血清或抗体按梯度稀释(如1:10、1:100、1:1000等),每个稀释度的抗体分别加入到不同孔中。

 

 

三、病毒与抗体孵育

 

1.取等体积的病毒液和不同稀释度的抗体混合。

 

2.在37°C条件下孵育1小时,使抗体与病毒结合。

 

四、细胞感染

 

1.将病毒-抗体混合物加入96孔板中的已汇合细胞。

 

2.在37°C、5% CO₂环境下孵育1小时,促进病毒感染细胞(可根据不同病毒与细胞的特点改变相关条件)。

 

3.吸掉未结合的病毒-抗体混合物,加入2%FBS培养基继续培养12-48小时(具体时间取决于病毒的复制周期)。

 

五、固定与染色

 

1.培养结束后,弃去培养基,使用4 %多聚甲醛固定细胞10-20分钟。

 

2.用PBS冲洗细胞3次,每次5分钟,确保去除残余固定液。

 

3.加入封闭液(如1% BSA)封闭细胞表面非特异性结合位点,室温孵育30分钟。

 

六、荧光标记

 

1.用荧光标记的抗病毒抗体孵育细胞,室温下孵育1小时或4°C孵育过夜。

 

2.孵育后,用PBS冲洗3次,去除未结合的荧光抗体。

 

七、结果读取

 

1.使用荧光显微镜或荧光读板仪检测荧光信号。阳性对照(无抗体组)显示病毒感染的荧光信号,而不同稀释度的抗体组显示荧光强度的减少。

 

荧光显微镜先被PEDV感染的Vero细胞,荧光染料为FITC

 

2.根据荧光强度的降低程度,可以确定抗体对病毒感染的抑制效果。

 

八、数据分析

 

根据抗体稀释度与荧光信号强度之间的关系,绘制中和曲线,计算中和抗体效价。通常使用50%中和效价(NT50),即能够中和50%病毒感染的抗体稀释度。

 

1.数据归一化:

 

首先,将最大病毒感染(没有抗体的对照组,0%中和)的荧光信号作为100%,没有病毒的空白对照(0%感染)作为0%。

 

2.使用公式计算每个稀释度下的中和百分比:

 

 

例如,未添加抗体组的荧光信号是5000,某个抗体稀释度下测得的信号是3000,则该稀释度的中和百分比为20%。

 

3.绘制中和曲线

 

横轴(X轴)表示抗体稀释度(通常采用对数刻度,如1:10、1:100、1:1000等)。纵轴(Y轴)表示中和百分比(从0%到100%)。绘制每个稀释度对应的中和百分比,得到一条中和曲线。中和曲线通常呈现S形,低稀释度时中和率接近100%,高稀释度时中和率接近0%。

 

4.计算50%中和效价(NT50)

 

(1)找到50%中和点:

 

根据绘制的中和曲线,找到中和率为50%时的点。

 

通过插值法在曲线中找到对应的抗体稀释度。比如,如果在1:100的稀释度下中和率为50%,那么NT50就是1:100。

 

(2)使用非线性回归拟合曲线(此步骤根据不同实验需求而定):

 

为提高精确度,可以使用非线性回归(如四参数逻辑回归,4PL)拟合中和曲线。计算出50%中和效价的精确稀释度值。

 

该方法通过拟合曲线的形式更为准确地找到NT50。

 

荧光中和实验的优势在于其灵敏度高、定量准确,适用于多种病毒和抗体的中和检测,特别是在研究抗病毒药物或疫苗时能提供定量数据。

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来源:实验老司机