摘 要： 建立高效液相色谱法同时测定呋塞米片中6种已知杂质，考察了分析方法的专属性、线性范围、灵敏度、准确度、精密度、稳定性及不同定量方式计算相同样品的差异。结果表明，呋塞米和6种已知杂质的质量浓度在1.0～12.0 μg/mL范围内与对应的色谱峰面积线性关系良好，相关系数大于0.999，且6种已知杂质的3种浓度水平加标回收率为95.2%～101.9%，测定结果的相对标准偏差均低于6.5%。该方法简便、快速，专属性强，准确度与精密度较好，可用于呋塞米片的质量控制。

关键词： 高效液相色谱法； 呋塞米片； 有关物质； 质量控制

 

呋塞米化学名为2-[(2-呋喃甲基)氨基]-5-(氨磺酰基)-4-氯苯甲酸，属于强效髓袢利尿药，常用于治疗充血性心力衰竭、高血压、水肿等疾病[1‒2]，因其利尿速度快、时间短，且不良反应小，使得呋塞米片常作为一线降压药使用[3‒4]。由于药物在货架期内受温度、湿度、光照等外界条件影响，主成分易遭受破坏，产生降解杂质[5‒6]。为保证患者的用药安全，现行版中国药典对其原料和注射剂的有关物质限度均进行规定，但未对呋塞米片的有关物质提出要求，而现行版美国药典对呋塞米片的有关物质仅控制了杂质B (4-氯-5-氨磺酰邻氨苯甲酸)的限度。根据文献报道，呋塞米的主要降解杂质共有6种，分别为杂质A、B、C、D、E、F[7]，且均不易购得，若在日常质量控制中，采取外标法定量分析呋塞米片中6种杂质的质量分数较难实现。高效液相色谱法测定呋塞米含量的研究较多[8‒10]，但未有文献对呋塞米片的有关物质控制研究进行报道，为此有必要建立一种简便、高效的分析方法同时测定呋塞米片中6种有关物质的质量分数。高效液相色谱法因具有操作简便、专属性强、准确度高、成本较低等优点，而被广泛应用于药物的含量和有关物质检测[11‒13]。以样品溶液中呋塞米质量浓度的1.0% (10.0 μg/mL)作为杂质控制限度，通过强制破坏实验，考察液相色谱条件对降解杂质的检出能力，及是否干扰6种已知杂质的色谱峰，并比较主成分自身对照法与外标法定量分析呋塞米片中有关物质质量分数的差异。该研究既可为准确测定呋塞米片中有关物质的质量分数提供参考，也能为相关产品的质量标准提升提供借鉴。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：U3000型，美国赛默飞世尔科技有限公司。

电子天平：(1)MS204/A型，感量为0.1 mg；(2)XPR226CDR/AC型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

pH计：400-B型，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

鼓风干燥箱：DHG-9078A型，上海捷呈实验仪器有限公司。

超声波清洗机：KS-20DQT型，望皖科技(上海)有限公司。

呋塞米片：20 mg/片，市售。

呋塞米对照品：质量分数为99.3%，中国食品药品检定研究院。

呋塞米杂质A对照品、呋塞米杂质B对照品、呋塞米杂质C对照品、呋塞米杂质D对照品、呋塞米杂质E对照品、呋塞米杂质F对照品：质量分数分别为97.2%、98.4%、98.1%、97.5%、98.6%、99.1%，加拿大TRC公司，具体名称见表1。

表1   呋塞米片6种有关物质

Tab. 1   Six kinds of related substances in furosemide table

 

盐酸、氢氧化钠、双氧水、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸二氢钾、氨水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

异丙醇：色谱纯，德国默克公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Ultimate C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；流动相：0.3%磷酸二氢钾溶液-0.4%十六烷基三甲基溴化铵(加入氨水调节pH值至7.0)-异丙醇(70∶30，体积比)，流量为1.0 mL/min；检测波长：238 nm；进样体积：20 μL；柱温：40 ℃。

1.3 溶液配制

稀释剂：0.3%磷酸二氢钾-0.4%十六烷基三甲基溴化铵(加入氨水调节pH值至7.0)-异丙醇(70∶30，体积比)。

样品溶液：取呋塞米片20片，研细后，精密称取适量(约相当于呋塞米50.0 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入20 mL稀释剂，超声溶解(100 W、5 min)后，用稀释剂定容、摇匀。测定时过滤，取续滤液，即得样品溶液。

混合对照品溶液：精密称取呋塞米杂质A、B、C、D、E、F及呋塞米对照品适量，用稀释剂稀释，配制得到每1 mL分别含有0.01 mg的杂质A、B、C、D、E、F及呋塞米混合对照品溶液。

空白辅料溶液：根据说明书所列辅料，配制空白辅料溶液。

对照样品溶液：精密移取样品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入稀释剂定容后摇匀。

1.4 实验方法

取样品溶液、混合对照品溶液和对照样品溶液，按1.2色谱条件进样分析，记录色谱图至主成分保留时间的2倍，记录色谱峰峰面积，按外标法与主成分自身对照法定量分析6种有关物质的质量分数，采用不加校正因子的主成分自身对照法测定其他杂质的质量分数。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 色谱条件选择

2.1.1 检测波长选择

取混合对照品溶液在200～400 nm波长的紫外吸收光谱下扫描，发现在238、271、333 nm波长处均有吸收，且越靠近短波长吸收强度较大，考虑待测物的检测灵敏度，并结合现行版欧洲药典对呋塞米原料药有关物质的检测波长为238 nm，选择检测波长为238 nm。

2.1.2 柱温选择

采用Ultimate C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，按照1.2色谱条件，分别考察不同柱温(25、30、35、40、45 ℃)对混合对照品溶液中各色谱峰的出峰影响。结果表明，当柱温在25、30、35和45 ℃时，杂质A与杂质C的分离度不符合要求，不能完全分离。当柱温为40 ℃时，呋塞米及其他6种杂质的色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5，因此选择柱温为40 ℃。

2.1.3 流动相选择

以0.3%磷酸二氢钾溶液-0.4%十六烷基三甲基溴化铵(加入氨水调节pH至7.0)为流动相A，异丙醇为流动相B，分别考察不同体积比(60∶40、70∶30、80∶20)对各色谱峰的出峰影响。结果发现，随着流动相中异丙醇的增加，呋塞米与其他6种有关物质的保留时间逐渐缩短，同时各色谱峰的分离度不断减小，当流动相A与流动B的体积比为70∶30时，各色谱峰的保留时间合适，且与相邻峰的分离度大于1.5，因此选择流动相为0.3%磷酸二氢钾-0.4%十六烷基三甲基溴化铵(加入氨水调节pH至7.0)-异丙醇(70∶30)。

2.2 专属性考察

按照1.2色谱条件，分别取空白辅料溶液、混合对照品溶液及样品溶液进样，系统适用性溶液色谱图见图1。空白辅料溶液、样品溶液中未有色谱峰干扰主成分与6种有关物质出峰，专属性好。另外主成分与其他6种有关物质的分离度均大于1.5，各色谱峰的理论塔板数均大于5 000，证明该色谱条件可使主成分与其他6种有关物质有效分离。

图1   系统适用性溶液色谱图

Fig. 1   Chromatogram of system suitability solution

1—杂质E；2—杂质B；3—杂质C；4—杂质A；5—呋塞米；6—杂质F；7—杂质D

 

2.3 主成分强制降解

根据文献中破坏试验方法[14‒15]，分别采取高温、光照、酸、碱、氧化和高湿条件对样品溶液进行破坏。具体操作如下：(1)取呋塞米片置于60 ℃下30 d，随后制备样品溶液，即得高温破坏试样；(2)取呋塞米片置于强光(4 500±500) lx下照射30 d，随后制备样品溶液，即得光照破坏试样；(3)向超声溶解的样品溶液加入1 mol/L盐酸溶液1 mL摇匀，置于60 ℃水浴2 h，再加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL中和，随后用稀释剂定容摇匀，即得强酸破坏试样；(4)向超声溶解的样品溶液加入1 mol/L氢氧化钠溶液1 mL后摇匀，置于60 ℃水浴2 h，再加入1 mol/L盐酸溶液1 mL中和，随后用稀释剂定容摇匀，即得强碱破坏试样；(5)向超声溶解的样品溶液加入30%过氧化氢1 mL后摇匀，于室温下放置6 h，用稀释剂定容摇匀，即得氧化破坏试样；(6)取呋塞米片置于25 ℃、相对湿度为90%环境下30 d后制备样品溶液，即得高湿破坏试样。将上述6种强制降解的试样，按照1.2色谱条件进样，测定各杂质的质量分数，结果见表2。由表2可知，强碱、氧化与高湿破坏的试样中杂质峰个数增长较少，表明呋塞米在上述破坏条件下较稳定，而在光照、强酸和高温破坏的试样中杂质增长量较多，但降解杂质的色谱峰均能与主成分有效分离，同时主峰纯度大于990，表明降解杂质与主成分色谱峰保留时间相同的可能性较低，另外物料平衡率(破坏后各色谱峰的峰面积之和/破坏前各色谱峰的峰面积之和)为96.3%～99.5%，表明该方法对主成分降解杂质的检出能力较强，方法专属性较好。

表2   呋塞米片的强制降解结果

Tab. 2   Forced degradation results of Furosemide Tables

2.4 线性范围考察

精密称取呋塞米及6种有关物质对照品各约10 mg，置于50 mL容量瓶中，用稀释剂定容、摇匀，作为混合对照品储备液。随后分别精密移取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL混合对照品储备液置于100 mL容量瓶中，用稀释剂定容后摇匀，便分别得到1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、12.0 μg/mL呋塞米与6种杂质的混合对照品溶液，按照1.2色谱条件进样，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，相应色谱峰面积为纵坐标，绘制线性回归方程。以呋塞米与6种杂质的线性回归方程斜率的比值，计算校正因子f，结果见表3。由表3可见，所有方程的相关系数均大于0.999，表明在1.0～12.0 μg/mL范围内，主成分和6种已知杂质质量浓度与相应色谱峰面积的线性关系良好。

表3   呋塞米与6种有关物质的线性方程、相关系数

Tab. 3   Linear equations and correlation coefficients of furosemide and 6 related substances

 

2.5 检出限与定量限

精密移取1.3中1.0 μg/mL混合对照品溶液少许，用稀释剂逐步稀释，按照1.2色谱条件进样，分别以基线噪音的3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)作为相应目标化合物的检出限与定量限 [16‒17]，结果见表4。由表4可见，6种有关物质的定量限质量浓度均不高于杂质的控制限度（10 μg/mL），从而满足呋塞米片中有关物质的定量分析要求。

表4   不同物质的检出限与定量限(n=6)

Tab. 4   LODs and LOQs in different substances (n=6)

 

2.6 准确度试验

准确称取研磨后的呋塞米片(呋塞米约为10 mg)，置于10 mL容量瓶中，加入5 mL稀释剂超声溶解(100 W、5 min)后，再分别加入低、中、高质量浓度的6种有关物质对照品溶液，用稀释剂定容避光摇匀，另配制不加杂质对照品的样品溶液，随后按照1.2色谱条件进样，测定各加标样品溶液中杂质的质量分数，并计算回收率，结果见表5。由表5可见，6种有关物质的加标回收率为95.2%～101.9%，表明该方法对呋塞米片中6种有关物质检测结果准确度较好。

表5   6种有关物质的回收率

Tab. 5   Recoveries of 6 related substances

注：“-”表示未检出，下同。

 

2.7 精密度试验

以厂家A生产的呋塞米片作为测定对象，由不同实验人员按1.4方法对其进行测定，样品平行测定6次，结果见表6。由表6可见，最大单个杂质检测结果的相对标准偏差(RSD)为5.2%～6.2%，杂质总量的RSD为2.4%～2.6%，说明该方法的精密度较好，满足不同实验室的分析要求。

表6   精密度试验结果

Tab. 6   Results of precision test ( % )

 

2.8 稳定性试验

按照1.2色谱条件考察10.0 μg/mL混合对照品溶液和样品溶液与对照样品溶液在0、4、8、12、18、24、30 h的色谱图，统计各溶液目标物的稳定性情况，具体见表7、表8。不同时间下混合对照品溶液中杂质A、B、C、D、E、F质量分数较0 h的最大绝对差值分别为0.01%、0.02%、0.01%、0.03%、0.02%和0.02%，可知各杂质色谱峰面积在30 h内无明显变化。不同时间下样品溶液中杂质总量较0 h的最大绝对差值为0.02%，而对照样品溶液中呋塞米的质量分数最大绝对差值为0.03%，表明样品溶液与对照溶液的最长存放时限均可维持30 h。

表7   混合对照品溶液的稳定性结果

Tab. 7   Stability results of mixed control solution ( % )

表8   样品溶液与对照样品溶液的稳定性结果

Tab. 8   The stability results of the sample solution and the control sample solution ( % )

 

2.9 样品有关物质检测结果

采取1.3色谱条件检测不同厂家生产的呋塞米片中有关物质，记录色谱图至主成分色谱峰保留时间2倍。根据表3中校正因子，采用主成分自身对照法计算6种有关物质的质量分数，并与外标法定量分析结果进行比较，另通过不加校正因子的主成分自身对照法计算未知单个杂质的质量分数，并计算杂质总量，结果见表9。从表9可见，不同厂家生产的呋塞米片中均能检出杂质B，但质量分数均低于0.3%。采用主成分自身对照法与外标法测定3家呋塞米片的6种有关物质的质量分数，最大绝对差值低于0.02%，可知两种定量方法无明显差异。为节省对照品，优选主成分自身对照法定量分析呋塞米片中有关物质质量分数。

表9   不同厂家呋塞米片的有关物质质量分数

Tab. 9   Contents of related substance of Furosemide Tables from different companies ( % )

 

3、 结语

 

建立了高效液相色谱法同时测定呋塞米片中6种有关物质质量分数，考察了6种已知杂质(杂质A、B、C、D、E、F)对主成分的校正因子，同时检测不同厂家生产的呋塞米片有关物质。通过强制破坏主成分，各破坏条件下样品中色谱峰总面积基本满足质量守恒要求，且空白溶剂与辅料对主成分与6种有关物质的检出无干扰，表明该方法能够对可能存在的工艺与降解杂质有效检出，专属性较好。另外在不同加标量下，6种有关物质的回收率为95.2%～101.9%，方法准确度较高。采取主成分自身对照法与外标法对同一样品的定量分析结果无明显差异，因此为降低检测成本，优选主成分自身对照法定量分析呋塞米片各有关物质的质量分数，从而满足相关产品有关物质的质量控制要求。

 

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引用本文： 邵雪力，康冰莹，费佳，等 . 高效液相色谱法同时测定呋塞米片中6种有关物质［J］. 化学分析计量，2024，33（10）：68. (SHAO Xueli, KANG Bingying, FEI Jia, et al. Simultaneous determination of 6 related substances in Furosemide Tables by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 68.)