肝移植是终末期肝病唯一的根本治疗方法，但供体短缺导致供需失衡。整体肝脏生物工程作为解决这一问题的潜在途径，主要包括肝脏脱细胞化和重新细胞化。脱细胞化保留了肝脏的细胞外基质和血管、胆管网络，重新细胞化则通过适当的细胞重建肝脏功能。本文综述了该领域的最新进展、面临的挑战，并探讨了未来的临床应用前景和监管措施。

 

1. 引言

 

慢性肝病，包括肝硬化、病毒性肝炎和肝癌，仍然是全球范围内导致死亡的主要原因之一，每年约有200万人死于肝病，占全球死亡总数的4%。此外，肝病还带来了高昂的医疗成本，给经济和财政带来了沉重负担。例如，2016年美国用于肝病患者的医疗支出就超过了325亿美元。异体肝移植仍然是治疗肝病的黄金标准，尤其是对于终末期肝病患者。尽管肝移植是全球第二大常见实体器官移植，但可用肝源数量与等待移植的患者数量之间仍存在显著差距。这一差距导致全球肝移植需求仅得到不到10%的满足，导致等待移植的患者死亡率显著上升。

 

为了弥补这一差距，研究人员使用组织工程方法研究了不同的替代治疗策略。组织工程作为再生医学的一个卓越领域，旨在将支架、细胞和生物活性分子组合成功能性组织，以恢复、维持或改善受损组织或整个器官。脱细胞化作为一种组织工程技术，已被用于为未来的移植提供可用的器官库(图1)。脱细胞化是指使用化学、物理和/或生物方法，从组织或器官中最大程度地去除细胞和核物质，同时保留其生化成分、生物活性、三维结构和细胞外基质的完整性。如果成功，脱细胞化将有助于开发模拟天然组织机械、生物和解剖特性的支架。去细胞化后，肝脏支架需要植入具有适当特性和功能的新细胞。除了肝实质细胞外，重建血管和胆管树网络对于生产出可移植到人体的完全功能性生物工程肝脏也是必不可少的。

 

多项已发表的研究表明，生物工程肝脏的生成效果令人期待。本文探讨了生物工程肝脏制造的最新进展，重点关注了重大障碍，例如细胞外基质的免疫原性、去细胞化技术的标准化以及用于再细胞化、再内皮化和胆管重建的合适细胞类型的鉴定。此外，本文还总结了用于评估生物工程肝脏功能的各种体内移植模型。最后，本文讨论了监管措施，并展望了生物工程肝脏疗法的安全性和有效性的未来前景。

 

多项已发表的研究已证明，生成生物工程肝脏具有良好的前景。本综述探讨了生物工程肝脏制造的最新进展，重点关注了细胞外基质免疫原性、脱细胞技术的标准化以及确定适合再细胞化、再内皮化和胆道重建的细胞类型等重大障碍。此外，还总结了用于评估生物工程肝脏功能的不同体内移植模型。最后，本综述讨论了监管措施，并提供了确认生物工程肝脏治疗的安全性和有效性的未来前景。

 

2. 脱细胞肝脏的来源

 

可用于脱细胞处理的肝脏来源多种多样。过去二十年，小鼠、大鼠、雪貂、兔子、绵羊、猪和人类的肝脏均被用于脱细胞处理。从临床角度来看，小鼠、大鼠、雪貂和兔子的脱细胞肝脏由于肝脏体积小和其他生理差异，不适合人体临床移植。由于长时间缺血、过度脂肪变性、尺寸不匹配或质量差而不适合同种异体人体移植的肝脏可能是一个有利的来源。2016年，美国采购了739个肝脏但未进行移植，占美国移植总数的9%。到2021年，被丢弃的肝脏数量已上升至总移植量的10%这些废弃的肝脏未来有可能被用于去细胞化和再细胞化的过程。

 

使用人体器官的一个显著缺点是细胞外基质(ECM)会随着年龄的增长而发生改变。据报道，随着年龄的增长，肝脏的硬度增加，弹性下降。这是由于胶原蛋白含量增加、瘢痕组织形成以及晚期糖基化终产物在ECM上积累引起的ECM交联所致。这些ECM微结构的变化可增强ECM对酶消化的抵抗力，导致人类肝脏之间出现显著差异。

 

猪由于器官大小匹配、可用性、成熟速度快、产仔量大、生理代谢和免疫系统与人类相似，且近十年来猪的基因工程技术取得了重大进展，被认为是人类规模肝脏生物工程最合适的来源。容易获得年龄相近的猪肝可能会限制与年龄相关的ECM生物学差异的影响，从而促进脱细胞过程的标准化。因此，从无病原体猪身上获取的肝脏可能是用于移植的生物工程肝脏的重要来源。

 

3. 猪肝与人肝的区别

 

由于猪肝可能是移植的潜在来源，因此有必要详细了解猪肝和人肝在结构和微观结构方面的差异。成年人肝脏呈楔形，分为2叶(左叶和右叶)，平均体积为1862cm3。相比之下，成年猪肝呈小叶三叶草状，分为4叶(右侧叶、右中叶、左中叶和左侧叶)，平均体积为652-1120cm3。尽管存在这些差异，但根据先前的研究，两种肝脏都分为8个相似的段。

 

人体肝脏中的肝动脉有两条分支，即左肝动脉和右肝动脉，分别供应相应的肝叶。猪肝动脉在到达肝门前分为左右两支，右支进一步分为右内侧支和右外侧支，为肝右叶提供血供。同样，左支也分为3支主要动脉，左内侧支和左外侧支(均供应左叶)，方支供应方叶和胆囊。由此可以得出结论：猪肝脏与人肝脏的动脉血液供应没有显著差异。

 

两种物种的胆管系统在解剖学和功能上相似，而胆管分割与门静脉分割相同，因为它们在格里森鞘内有共同的轨道。猪肝胆管引流的一个显著特点是：猪I段胆管引流是通过右肝管进行的，而人I段胆管引流是通过左肝管进行的。就组织微观结构而言，猪肝和人肝均表现出相似性。实质结构组织成边界清晰的六边形小叶，以中央静脉为中心，其角落处有门管三联体。这些小叶由大型多边形肝细胞组成，这些肝细胞堆叠在一起，并由含有不同数量结缔组织的纤维隔膜隔开。这些肝细胞估计约占肝组织的80%，而其他非实质细胞占20%门脉三联由肝动脉、门静脉和胆管组成，周围被疏松结缔组织包围。重要的是，肝窦位于肝细胞条带之间，流入中央静脉主要的组织学差异是存在较多的胶原蛋白，尤其是在猪肝小叶周围的结缔组织隔膜中，而人类肝实质中没有这些隔膜。Estermann等人评估了猪肝和人肝的机械性能他们报告称，猪肝比人肝更硬，这可能是由于两种组织之间的组织学差异造成的。此外，猪肝与人肝相比，拉伸负荷更高，但粘弹性能无差异。

 

4. 生物工程肝脏临床应用的障碍与挑战

 

4.1 ECM免疫原性

 

器官脱细胞是制造ECM支架的关键工序，旨在消除免疫原性细胞材料，从而降低同种异体和异种异体衍生支架的免疫原性。植入后，这些天然ECM支架会发生一定程度的降解，释放基质肽和生长因子。该过程触发巨噬细胞极化从促炎(M1)表型转变为抗炎再生表型(M2巨噬细胞)，促进血管生成并募集干细胞/祖细胞到植入组织进行建设性重塑总体而言，如果脱细胞组织完全去除了不同来源的免疫原，则其排斥率可能会降低。DNA和异种表位(例如alpha-Gal和Neu5GC)的存在以及ECM的年龄和完整性等因素在影响脱细胞组织的免疫原性方面发挥着重要作用。

 

4.1.1 脱氧核糖核酸

 

一些研究人员强调了猪源支架内残留DNA的重要性及其对植入后免疫反应的影响。虽然尚未广泛研究ECM中足以引发负面重塑反应的残留DNA的具体阈值，但许多研究人员建议，脱细胞组织理想情况下每毫克ECM干重应含有少于50ngdsDNA。最近，RecordRitchie等人从未加工的猪小肠ECM和灭菌前后的脱细胞ECM中纯化DNA。他们将50μgDNA注射到小鼠体内，其中有或没有强共刺激剂，如不完全弗氏佐剂、甲基化牛血清白蛋白和白细胞介素-12。值得一提的是，从未处理、无菌或灭菌的猪ECM中分离的DNA，在未使用佐剂注射时，不会引起排斥反应。相反，它在局部诱导了轻微的适应细胞因子反应，没有观察到全身性抗DNA抗体表达，即使剂量比ECM植入预期的剂量高出约100倍。这项研究，加上美国食品药品监督管理局(FDA)没有对生物支架中DNA的存在施加限制或约束的事实，强调了DNA含量并不是脱细胞效率的可靠指标。FDA的立场基于制造商提交的产品安全数据，这些数据支持DNA存在不一定与抗原性相关的观点。因此，有必要探索一种替代的、更精确的标准来评估脱细胞组织的抗原性。

 

4.1.2 异种表位

 

Alpha-Gal表位(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R)是猪等非灵长类哺乳动物细胞表面发现的特定碳水化合物结构。由于α1，3-半乳糖基转移酶基因突变，这些表位在人类和旧世界猴中不存在人类缺乏alpha-Gal表位，导致产生抗Gal抗体(约占血清抗体的1%)，这主要是由于接触携带这些表位的肠道细菌所致。猪组织和器官(包括肝脏)中广泛存在alpha-Gal，这使得它们容易因异种移植特异性免疫反应而受到排斥。脱细胞化已被证明能够有效去除或减少猪肝中的alpha-gal含量在非人类哺乳动物中，Neu5Gc(N-乙醇酰神经氨酸)表位是异种移植排斥的另一种重要抗原。由于基因突变，人类缺乏功能性胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)，该酶负责将Neu5Ac(N-乙酰神经氨酸)转化为Neu5GC，导致人体组织中缺乏Neu5GC。因此，人类可能会产生针对Neu5GC的抗体，从而导致含有该抗原的移植物发生超急性排斥反应。遗憾的是，此前在猪肝脱细胞过程中，并未评估过Neu5Gc抗原的存在。因此，从猪肝中去除该抗原的效果仍不确定，这强调了进一步研究以确定脱细胞后是否需要进行特定酶处理的重要性。

 

4.1.3 ECM改造

 

ECM含有不同的隐秘肽，可以刺激或抑制宿主的免疫反应。脱细胞化过程可能通过暴露隐藏的免疫原性区域、将脱细胞组织内的惰性分子转化为免疫原性颗粒或消耗免疫调节物质来增加组织的免疫原性。例如，严苛的脱细胞程序可能会揭示胶原蛋白的某些隐蔽螺旋和末端抗原位点，从而引发针对ECM的抗体产生。此外，Adair-Kirk等人还发现，酶处理可导致层粘连蛋白α5的特定隐蔽表位释放，从而产生16个氨基酸肽，该肽表现出吸引多形核白细胞(PMN)和巨噬细胞的能力，以及诱导免疫细胞产生基质金属蛋白酶9(MMP-9)的能力。

 

弹性蛋白受损会导致弹性蛋白肽的释放，无论是通过严酷的脱细胞过程还是糖胺聚糖(GAG)的消耗。GAG在保护弹性蛋白免受蛋白酶活性的影响方面起着至关重要的作用释放的弹性蛋白颗粒可诱导单核细胞趋化作用，促进T辅助细胞分化为炎症表型(TH1和TH17)，并促进抗体介导的炎症反应。

 

此外，高分子量透明质酸(脱细胞ECM中的可识别GAG)通过阻碍抗原和抗体之间的相互作用表现出抗炎作用。它们还激活Toll样受体(TLR)，即模式识别受体(PRR)的一个特定子集，以及在先天和适应性免疫细胞中发现的CD44受体这些受体的激活与树突状细胞成熟度降低、巨噬细胞向M2表型极化增强、T细胞分化为调节表型以及活化T细胞凋亡诱导有关。相反，当ECM受到损伤或降解时，会释放低分子量透明质酸。它们通过相同的受体CD44和TLR增强免疫细胞趋化性、树突状细胞成熟和巨噬细胞向M1表型极化。

 

4.1.4 ECM的年龄

 

ECM来源的年龄是影响ECM基生物材料免疫学特性的关键决定因素。例如，LoPresti和Brown使用来自不同年龄(12、26和52周)猪的脱细胞小肠粘膜下层(SIS)研究了年龄对来自2或18个月龄小鼠的骨髓巨噬细胞表型和功能的影响。研究结果表明，与12周龄SIS相比，从52周龄猪身上获得的SIS可减少2个月龄巨噬细胞中的iNOS生成，并抑制2个月龄和18个月龄巨噬细胞中的Fizz1表达。该研究表明，与年轻对照相比，来自老年动物的ECM会产生不同的巨噬细胞表型，这强调了从年轻捐赠者那里获取ECM的重要性，以保持ECM生物材料建设性重塑的良好结果。

 

重要的是，从老年人尸体心脏中提取的心肌经过了额外的脂质和DNA/RNA去除步骤，以去除老年人心肌中常见的大量脂肪组织，并将核苷酸含量降低到与猪心肌基质类似的治疗应用可接受标准，实现组织的完全脱细胞化。此外，层粘连蛋白、弹性蛋白和生长因子的含量随着年龄的增长而减少。因此，考虑组织来源的年龄对于预测潜在的宿主免疫反应至关重要。需要进一步研究获取肝组织进行脱细胞化的最佳年龄，以生产具有高含量生长因子和促进再细胞化和血管化所必需的基本成分的脱细胞支架，在生物降解前实现体内建设性重塑。

 

4.2 肝支架制作的标准化

 

4.2.1 脱细胞

 

尽管在20世纪70年代和80年代首次报道了从组织中分离细胞外基质(ECM)的尝试，2008年Ott等人首次成功进行了整个器官脱细胞实验他们通过向冠状动脉灌注去污剂12小时，成功构建了大鼠全心脏支架，这一成果标志着全器官组织工程领域的重大突破。2010年，Uygun等人证明了通过在大鼠肝脏中灌注去污剂72小时，获得全脱细胞支架的可行性。在用大鼠肝细胞进行再细胞化后，他们将再细胞化的肝脏异位移植8小时。对移植物进行检查发现肝细胞能够保持其正常形态和功能。此后，几个研究小组报道了使用不同方法和试剂进行肝脏去细胞化。

 

4.2.1.1 脱细胞剂

 

尽管已经采用了各种方法(包括物理、化学和酶处理或这些方法的组合)来进行肝脏脱细胞化(图2)，很难将其中任何一种药物视为一种理想的方法，能够有效平衡组织细胞质和核内容物的消耗，以及能够促进重新接种的细胞的附着、生长和分化所必需的结构和生物活性ECM成分的保存。

 

4.2.1.1.1 化学方法

 

化学处理通常用于肝脏脱细胞化，包括离子、非离子和两性离子洗涤剂、醇、酸、碱和低渗/高渗溶液。虽然化学药剂在脱细胞和去除脱细胞组织中的免疫原性物质过程中起着关键作用，但它们可能会造成ECM损伤并影响所得脱细胞组织的生物相容性。

 

4.2.1.1.1.1 清洁剂

 

十二烷基硫酸钠(SDS)和TritonX-100分别是用于脱细胞的常用离子和非离子试剂。SDS可以通过破坏蛋白质-蛋白质相互作用使蛋白质变性并裂解细胞，而TritonX-100可以破坏脂质-脂质、脂质-蛋白质和DNA-蛋白质相互作用，同时保留蛋白质-蛋白质相互作用。因此，SDS可能会对ECM结构产生负面影响，破坏蛋白质成分(包括胶原蛋白)的结构，而TritonX-100不会改变ECM蛋白质结构，而是对细胞产生影响。值得注意的是，研究表明，由于胶原纤维结构的破坏和隐蔽抗原的暴露，经SDS处理的ECM支架在植入后通常具有更高的反应性。然而，一项研究报告称，TritonX-100倾向于将DNA分解成更大的碎片，这可能会引发不良的组织重塑反应。这一发现表明，虽然TritonX-100比SDS更好地保存了ECM蛋白质结构，但它仍可能因残留DNA而带来一些免疫原性风险。

 

4.2.1.1.1.2 酸和碱

 

酸和碱可以溶解细胞的细胞质成分，并通过催化生物分子的水解降解去除核酸物质。0.1%浓度的过氧乙酸(PAA)是肝脏脱细胞和灭菌最常用的酸，但它对GAG、生长因子和ECM的机械特性有不利影响。Hussein等人证明PAA能够高效地从薄肝切片中去除细胞物质，并能够对支架进行消毒。经过PAA处理后，脱细胞肝脏保留了56%的GAG含量。同样，氢氧化钠和氢氧化铵已与TritonX-100和SDS等洗涤剂结合使用，以对生长因子产生最小的有害影响来脱细胞肝脏这些碱性试剂可以在pH值高于11时分离DNA链，提取细胞成分，并且被认为与随后的再细胞化过程具有细胞相容性。

 

4.2.1.1.1.3 醇类

 

醇类，包括乙醇和异丙醇，通常用于通过脱水组织并随后裂解细胞来降解和消除组织中的脂质。由于乙醇对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、抗酸菌以及亲脂性病毒具有很强的杀菌作用，许多研究人员已使用乙醇对肝脏进行脱细胞和灭菌然而，基于乙醇的脱细胞方法存在组织固定、ECM超微结构损伤、细胞蛋白沉淀等缺点沉淀后，这些蛋白质不再可溶，无法洗掉，从而会在支架内留下残留的细胞蛋白。蛋白质组学分析证实了这一点，该分析发现酒精处理后支架中残留了大量细胞蛋白。

 

4.2.1.1.1.4 低渗/高渗溶液

 

高渗溶液(例如氯化钠)和低渗溶液(例如Tris-HCl)由于渗透压导致细胞收缩或肿胀，最终导致细胞裂解和细胞成分从细胞中去除。它们将抗原细胞残留物分散到整个组织中，对ECM结构和成分的破坏最小。这些溶液的主要优点是易于从组织中洗掉，以及能够去除其他残留的脱细胞化学物质，从而降低毒性并提高脱细胞组织的生物相容性。尽管高渗溶液能有效去除蛋白质，低渗溶液能有效去除细胞核和DNA，但它们可能无法完全消除细胞残留物，可能需要额外的处理来促进细胞碎片的去除。因此，它们与其他化学或酶试剂结合使用时可以改善肝脏脱细胞。Kobes等人报道，用低渗溶液连续搅拌小鼠肝脏，然后浸泡在TritonX中，可实现有效的脱细胞，扫描电子显微镜成像显示没有细胞，且结构完整性得以保留，证实了这一点。

 

4.2.1.1.2物理方法

 

物理脱细胞技术利用温度、压力和其他物理特性来分解细胞膜，帮助从组织或器官中去除细胞。尽管这些技术毒性低，但它们通常无法完全消除所有细胞成分，导致脱细胞材料中残留大量免疫原性细胞残留物。因此，它们通常被用作辅助治疗，以补充化学和生物制剂的作用，从而增强脱细胞过程的整体功效。

 

4.2.1.1.3酶法

 

使用核酸酶、胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶、分散酶、磷脂酶和胶原酶的酶处理是常用的脱细胞方法。尽管酶通过靶向细胞碎片或细胞基质内的特定键或相互作用去除细胞成分具有很高的特异性，但仅使用酶完全脱细胞整个器官仍存在挑战。此外，酶的高成本也构成了障碍，因为脱细胞大型肝脏需要大量的酶。此外，酶残留物可能会对再细胞化过程产生负面影响，或刺激不良的免疫反应因此，酶处理(特别是涉及核酸酶和胰蛋白酶)通常与化学洗涤剂结合，然后进行各种清洗循环，以实现肝脏脱细胞化。

 

4.2.1.2 脱细胞剂的应用方法

 

这些试剂可通过浸泡搅拌或灌注的方式应用。搅拌通常用于肝切片脱细胞，以优化最佳脱细胞或灭菌试剂。对于全肝脱细胞，灌注是常用的技术。

 

4.2.1.2.1 浸泡和搅拌

 

浸泡和搅拌是一种相对简单的脱细胞方法，常用于缺乏血管通路的薄组织和较小器官，例如食道、小肠粘膜下层、膀胱、血管、气管、皮肤、角膜和神经。该过程涉及将组织浸入化学或生物制剂中，同时对其进行持续的机械搅拌。这种方法可加速细胞破碎、脱离基底膜、去除细胞成分，确保均匀暴露于脱细胞试剂中，并在减少暴露于刺激性试剂的时间的情况下实现有效的脱细胞。

 

4.2.1.2.2 灌注

 

灌注是通过插管的内在血管系统输注化学或生物制剂，是去除肝脏等大而厚的致密器官细胞的理想方法。这种技术可确保脱细胞试剂在整个组织中均匀扩散和浸润，便于清除细胞和核物质。基于灌注的脱细胞技术备受关注，因为它能完整地保留三维ECM结构，这对于生产临床规模的肝脏用于人体移植至关重要。此外，灌注保留了固有的血管网络(门静脉、肝动脉和肝静脉)，这是在再细胞化过程中和体内移植后在肝脏内运输营养物质和氧气所必需的。此外，胆管树在灌注脱细胞后仍能维持，只需胆管细胞重新灌注即可恢复功能。重要的是，灌注脱细胞的效率取决于多种因素，包括灌注途径(肝动脉或门静脉或下腔静脉)、灌注方向(逆行或逆行)、灌注条件(控制压力和流速)、灌注持续时间、脱细胞制剂的类型和浓度以及肝脏的大小。灌注条件不当导致ECM损坏、需要血管插管、需要特定的灌注泵和复杂的流量控制装置是灌注法的主要缺点。

 

4.2.2 交联

 

在再细胞化过程中以及体内移植后，脱细胞肝脏可能会发生分解过程，称为“生物降解”，这会对ECM的生物力学强度产生负面影响。交联剂已被成功用于增强酶抗性、基质分解，并最终提高各种组织和器官的生物机械强度此外，交联已被建议通过掩盖胶原蛋白中存在的抗原标记来最大限度地减少对移植脱细胞组织的潜在免疫反应。戊二醛已被用作一种有效的交联剂；然而，它有几个并发症，如细胞毒性和钙化王等人利用天然交联剂京尼平对猪肝进行交联，然后用1%TritonX-100和1%SDS进行灌注脱细胞处理。他们通过在交联的脱细胞肝脏上培养人内皮细胞(EA.hy926)或原代大鼠肝细胞来检查支架的生物相容性。京尼平交联对原代肝细胞和内皮细胞活力的抑制作用不显著，而戊二醛交联则表现出显著的细胞毒性。将交联支架植入大鼠部分厚度腹壁缺损模型后，京尼平处理的支架主要引发M2巨噬细胞表型反应，而戊二醛处理的支架导致宿主组织重塑中断和混合巨噬细胞极化特征。然而，尽管京尼平具有生物相容性和有效性，但由于支架经京尼平处理后呈现深蓝色，成本高，提取工艺复杂，京尼平的临床应用受到限制。

 

4.2.3 灭菌

 

脱细胞肝脏的终末灭菌是生物反应器中细胞体外培养和最终体内植入的先决条件。理想的灭菌剂/方法不仅应有效杀死或去除微生物，还应安全、易于使用，并且对支架的生物相容性、物理或生物活性的影响最小。因此，选择灭菌剂/灭菌方法至关重要。乙醇、PAA、微酸性电解水、PAA/乙醇、辐射和抗生素已被用于脱细胞肝脏的灭菌在我们之前的研究中，我们比较了0.1%PAA、70%乙醇和微酸性电解水对脱细胞猪肝切片2小时的灭菌效果。SAEW和PAA均能有效地对支架进行灭菌，而不会影响胶原蛋白，而乙醇会降低胶原蛋白的含量，并且在补充有10%FBS的DMEM和哥伦比亚血琼脂培养基中孵育时不能有效地对支架进行灭菌。

 

4.2.4 评价制备的肝支架的标准

 

不同实验室用于肝脏脱细胞的方案差异很大，目的是在去除细胞和核物质的同时保留ECM结构和生物活性，以避免支架在体内移植后引起宿主反应。要达到这种平衡，需要仔细优化脱细胞方案，以有效去除细胞物质，同时保留必要的ECM结构和生物活性分子。不同的因素会影响这种平衡，包括脱细胞剂的选择、浓度和治疗持续时间。此外，脱细胞过程中施加的机械力(例如搅拌或灌注)应精确控制，以尽量减少对ECM的破坏。对于商业化生产肝脏支架，应采用标准化、高效的脱细胞技术。脱细胞支架制备完成后，棕色会变成浅色或透明的白色；然而，这种颜色变化并不能保证支架的有效脱细胞。最初，Badylak和他的团队根据对体内重塑和免疫反应的各种研究，提出了三个必要的标准来确保脱细胞效率。第一个标准是在用DAPI或苏木精和伊红(H&E)染色的切片中缺乏核物质。第二个标准是ECM中的DNA耗尽，使用市售的dsDNA试剂盒定量，支架含有少于50ngdsDNA/mgECM干重。第三个标准是DNA片段长度应小于200bp，通过凝胶电泳测定。DNA最初被用作脱细胞的间接测量标准，因为它很难去除。这种困难使其成为评估细胞从支架中去除的彻底程度的实用方法。但是，现在人们认识到DNA含量并不是脱细胞效率或支架安全性的有力指标，因为FDA并不要求DNA含量规范，因为制造商提交了机密的产品安全数据。根据我们在脱细胞领域的经验，我们建议通过PCR、免疫染色或ELISA定量来评估alpha-Gal的缺失情况，以确认alpha-Gal已完全耗尽。此外，由于猪内源性逆转录病毒(PERV)存在人畜共患传播的风险，通过PCR确保脱细胞猪肝内完全不存在PERV至关重要。此外，研究关键ECM成分(包括胶原蛋白、GAG和生长因子)的保留也同样重要，这些成分对于维持组织的结构完整性和生物功能是必不可少的。

 

4.3 实质区域的重建

 

再细胞化是指将特定类型的细胞植入脱细胞组织中，以形成具有特定结构和功能、模拟原始组织的工程化结构。该过程包括两个主要步骤：第一步是接种细胞，使它们分布到脱细胞肝支架内的适当位置。第二步是在生理条件下通过主血管用培养基灌注整个肝脏，以模拟体内状态。肝脏由异质性细胞类型组成，包括肝细胞、胆管上皮细胞(胆管细胞)、内皮细胞、星状细胞、库普弗细胞、祖细胞和未分化细胞。因此，构建可移植且具有功能的生物工程肝脏需要这些不同的细胞不仅重新填充实质空间，还需要重新填充血管内壁、窦状隙和胆道网络。

 

在肝移植方面，一些研究表明，移植约20-30%的正常肝脏质量即可为接受者提供足够的功能。例如，体重70公斤的人需要大约840亿个肝细胞才能达到至少30%的肝功能因此，从理论上讲，脱细胞支架内肝实质的不完全重新植入可能就足够了，因为重新植入的肝细胞可以在体内增殖以填充实质，.但该假说尚缺乏确凿的证据。

 

4.3.1 细胞来源

 

4.3.1.1 原代肝细胞

 

原代人肝细胞由于具有较高的宿主相容性，是用于临床的生物工程肝脏重建的首选。然而，原代人肝细胞很少可用，主要来源于废弃的尸体肝脏样本。此外，它们的寿命短、增殖能力差，并且肝脏特异性功能和形态的丧失很快。在不同的再细胞化试验中，猪肝细胞已被探索作为原代人肝细胞的替代品。Yagi等人将原代猪肝细胞和灌注培养基以4mL/min的速度通过门静脉重新接种到脱细胞猪肝中，氧分压约为300mmHg。重要的是，他们报告说，到第7天，大约有47.8%的重新接种肝细胞凋亡。此外，他们观察到与第4天相比，培养基灌注7天后的白蛋白免疫染色较低，这归因于培养基流引起的剪切应力。

 

4.3.1.2 人类肝细胞系

 

为了解决使用原代肝细胞的挑战，肿瘤衍生的肝细胞系(如HepG2细胞)已被广泛用于重新填充脱细胞肝脏的实质空间。这种选择受到青睐，因为它具有可用性、快速生长、低成本扩增以获得足够的细胞数量进行再细胞化以及分泌人类蛋白质的优势。HepG2细胞可有效重新填充脱细胞大鼠、猪和人类肝脏，同时保留其功能和增殖能力。与未经处理的猪肝相比，在对血管树进行有效的再内皮化并用肝素-明胶混合物涂覆后培养的HepG2细胞表现出更高的功能基因表达，包括白蛋白、低密度脂蛋白受体(LDLR)和CYP2E1，以及增加的白蛋白分泌。这强调了有效的再内皮化在保护实质细胞免受培养基灌注引起的剪切应力和增强肝细胞功能方面的重要性。然而，从临床角度来看，与原代肝细胞相比，HepG2细胞由于其致瘤性和缺乏正常的代谢特征(尤其是尿素生成)，并不是临床应用的好选择。

 

4.3.1.3 人胎儿肝细胞

 

人类胎儿肝细胞(Hfh)因其增殖和功能能力而被视为再细胞化的替代细胞来源。重要的是，这些细胞没有经过基因改造，因此致瘤风险低于肝癌细胞系或永生化人类细胞系。此外，不存在人畜共患病传播风险和异种肝细胞常见的免疫问题。经过13天的灌注期后，人胎肝细胞与胎儿星状细胞共培养，能够重新植入脱细胞猪肝，其中70%的细胞对白蛋白染色呈阳性。有趣的是，随着灌注期的延长，表达下降。免疫组织化学染色显示甲胎蛋白(AFP)和CYP3A7表达降低，CYP3A4、细胞角蛋白(CK)-18和过碘酸-希夫(PAS)表达增加，表明随着灌注的进行，Hfh有望成熟。使用人类胎儿肝细胞的主要挑战在于其可用性、伦理问题以及胎儿细胞的功能成熟度不完全。

 

4.3.1.4 间充质干细胞

 

间充质干细胞(MSCs)可从骨髓和脂肪组织等不同来源获得。自体间充质干细胞因其可获得性、可扩增性、安全性以及可能有益的免疫调节作用，被认为是肝组织工程中一种潜在的临床相关细胞类型。Jiang等人通过门静脉将来自小鼠骨髓的间充质干细胞重新注入脱细胞小鼠肝脏，并在介质灌注过程中诱导其向肝系分化。与在二维培养基中分化的细胞相比，脱细胞肝脏的三维环境支持间充质干细胞的肝脏分化，表现为肝脏特异性基因和标记蛋白的表达水平更高，糖原储存、白蛋白分泌和尿素生成增加。

 

4.3.1.5诱导性多能干细胞

 

诱导性多能干细胞(iPSC)是一种多能细胞，可通过过度表达四种转录因子(Oct4/3、Sox2、Klf4和c-Myc)对人类或动物分化的成体细胞进行重新编程而产生。然后这些细胞可以重新分化为肝细胞样细胞。Park等人从耳皮肤成纤维细胞中产生了猪iPSC，并使用溶解的脱细胞猪肝提取物将它们分化为肝细胞(iPSCs-Hep)，然后将iPSCs-Hep通过门静脉重新植入脱细胞大鼠肝脏中，并在支架实质内良好分布，表现出将白蛋白和尿素分泌到灌注液中的能力。

 

4.3.2 再细胞化方法

 

将细胞重新植入脱细胞肝脏可通过直接注射到实质或通过肝胆血管灌注实现。鉴于肝脏的主要血液供应是通过门静脉，门静脉具有宽腔和广泛的分支，因此后者通常用于肝细胞植入。Zhou等人进行了一项研究，比较了水牛大鼠肝(BRL)上皮样细胞在实质内注射或门静脉灌注后的再植入效率。他们将细胞注射到脱细胞大鼠肝实质内的10个位置或将其注入门静脉。通过门静脉输注输送的细胞导致植入率低(83.4%±5.2%)且接种细胞分布较差，而实质注射导致植入率高(93.2%±4%)且24小时后细胞在实质空间中的分布更好。这种差异归因于重新接种的细胞倾向于阻塞门静脉管腔并被冲出支架。

 

4.4 血管重建

 

在脱细胞过程中，内皮细胞层通常与其他实质细胞一起被去除。ECM成分，尤其是支架中存在的胶原蛋白，在与血流中的循环血小板接触时可以刺激活化途径。因此，在肝脏支架体内移植后，预计血小板聚集和凝固会立即发生，这可能会阻碍器官的血液供应并导致细胞死亡。因此，重建血管网络是必要的，以使移植物能够用宿主血液灌注，确保向生物工程器官的不同区域供应营养和氧气，据报道，一般来说，细胞只能在距离营养和氧气源约1-3毫米的区域内存活。氧供应至关重要，通过动脉血(肝动脉)和静脉血(门静脉)在肝窦内以约1.2nmol/s/106个细胞的速度混合，肝细胞需要氧，从而满足氧需求并维持肝细胞的高代谢活动。考虑到这一点，内皮化效率低下可能导致坏死性死亡，并伴有移植物性能不佳和潜在的排斥反应。

 

虽然向现有血管中注入细胞因子是一种简单的技术，依赖于细胞因子粘附在血管管腔表面的能力，但部分细胞因子渗出血管结构外进入实质组织、细胞在生理流动条件下脱落以及窦状等微血管结构的再内皮化仍是实现脱细胞肝脏完全再内皮化的障碍。因此，要防止血小板粘附和血栓形成，就必须提高再内皮化的效果。

 

4.4.1 提高再内皮化效率

 

大量研究探索了不同的药物来促进EC粘附和/或增强细胞支架相互作用，以促进EC在脱细胞肝脏内的附着、生长和增殖。这些药物，如抗血栓剂、抗体、生长因子和/或ECM蛋白，通过各种机制发挥作用，如下图所示图3和图4。

 

 

 

4.4.1.1 肝素

 

肝素是一种天然存在的高度硫酸化的糖胺聚糖，常用作抗血栓形成剂。在制备不同的生物材料时，表面固定化肝素可与EC上的血管内皮生长因子受体(VEGFR)相互作用，阻止血小板粘附，从而改善涂层表面的血液相容性。Bao等人首先描述了肝素在大鼠肝脏支架中的固定作用，主要是为了减少体内凝血，而不是提高再内皮化效率。他们通过逐层自组装技术用肝素预处理脱细胞肝叶，用大鼠肝细胞球体对其进行再细胞化，并将其植入肝切除率为90%的啮齿动物模型的门静脉系统中。移植后的移植物支持肝功能72小时，保留了肝细胞形态，延长了动物存活时间。此外，他们在另一项涉及临床规模猪肝的研究中也采用了类似的方法，然后用大鼠原代肝细胞和HUVECs进行再细胞化。他们观察到，肝素处理可有效防止生物工程肝脏在体内植入后的血液灌注过程中出现血栓。

 

4.4.1.2 明胶

 

明胶是水解胶原蛋白得到的一种高分子量天然蛋白质，具有良好的生物相容性和生物降解性。Meng等人在明胶水凝胶中灌注内皮细胞，以改善脱细胞肝脏支架的再内皮化。他们报告称，与在罗斯威尔帕克纪念研究所(RPMI)培养基中灌注内皮细胞相比，脱细胞肝脏支架中注入的内皮细胞保留率明显提高，从而使血管腔周缘覆盖率更高。Hussein等人将肝素和明胶混合，在血管表面形成粘性表面，提高了脱细胞猪肝的再内皮化效率(图4)。此外，他们在脱细胞肝脏中共培养了HepG2细胞和内皮细胞，并将其异位移植到猪体内，观察到与未涂层的肝脏支架相比，没有明显的血栓形成，肝细胞功能更好。

 

4.4.1.3 抗CD31抗体

 

有人研究了肾脏和肝脏血管表面的CD31抗体连接。Ko等人用CD31抗体预处理脱细胞猪肝支架，然后用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)固定。然后，他们将小鼠EC(MS1)注入门静脉、肝动脉、肝上下腔静脉和肝内下腔静脉。通过这种方法，血管结构的管腔内出现了排列整齐、分布均匀的心肌细胞，体外血液灌流时血小板的粘附性显著降低(图4)。异位移植到猪体内后，再内皮化的肝脏可维持宿主生理血流长达24小时。Kim等人在脱细胞大鼠肝脏上涂覆抗CD31合子或抗CD31抗体，然后在支架上播种HUVEC细胞并进行生物反应器培养7天。如图4所示，与抗CD31抗体相比，在抗CD31合剂涂层存在的情况下，可观察到沿血管腔形成连续的内皮，从而使整个肝脏构建体的内皮化更有效。

 

4.4.1.4 与ELP结合的REDV

 

Devalliere等人通过门静脉注入与弹性蛋白样肽(ELP)共轭的Arg-GluAsp-Val(REDV)，ELP可在热触发时聚合成融合蛋白，从而包裹脱细胞大鼠肝脏内的血管，改善内皮细胞的附着。ELP序列使生物聚合物具有原生弹性蛋白的机械特性，而REDV则通过靶向粘附受体α4β1整合素来增强附着力。值得一提的是，这些受体只存在于心血管细胞表面，而不存在于血小板上。REDV肽对心血管细胞的这种特异性亲和力使其成为增强生物工程肝脏再内皮化的绝佳候选物质。Uygun和她的同事通过用REDV-ELP灌注脱细胞肝脏证实了这一点，结果显示EC的附着、扩散和增殖显著增加，血管壁上的内皮单层也在生长(图4)。此外，REDV-ELP共轭可减少富血小板血浆体内外灌注时血小板的粘附和活化。

 

4.4.1.5 纤连蛋白

 

纤连蛋白是一种大型粘附性糖蛋白，被认为是脱细胞组织中的主要成分，已被广泛用于与生物材料表面共轭，以加速EC的附着、扩散和分化。Watanabe等人研究了纤连蛋白与流动机械应力相结合增强再内皮化的能力。在通过门静脉将HUVECs导入大鼠肝脏之前，先用纤维连接蛋白处理脱细胞大鼠肝脏。与2.4mL/min和9.4mL/min的灌注速度不同，4.7mL/min的灌注速度有助于窦状规模微血管的生成。此外，研究还发现，在4.7mL/min的灌注培养过程中，在脱细胞肝脏支架上加入纤连蛋白涂层可促进窦状规模微血管的生成。然而，Watanabe等人的研究存在一个局限性，即作者没有在体外血液灌流系统或体内评估脱细胞肝脏内血管网络的血液相容性。值得一提的是，据报道，使用纤维连接蛋白等ECM蛋白有几个缺点。例如，使用纤连蛋白可能会导致受体产生免疫反应。此外，固定蛋白在暴露于培养基时表现出高度不稳定性和降解性。此外，纤维粘连蛋白具有很高的血栓形成潜能，当涂覆纤维粘连蛋白的生物材料与患者体内血液接触时，可启动凝血级联反应。

 

4.4.1.6 其他制剂

 

其他制剂，包括褐藻糖胶(FU)、层粘连蛋白、透明质酸(HA)、硫酸软骨素、1型胶原和血管内皮生长因子(VEGF)，已被用于改善纳米和金属支架表面以及心脏瓣膜和血管等薄组织的内皮化。这些制剂能与细胞内皮相互作用，诱导粘附，并与血小板相互作用，降低血栓形成的风险，从而有可能增强脱细胞肝脏内的再内皮化。要评估这些制剂在提高脱细胞肝脏支架再内皮化效率方面的功效，还需要进一步的研究。

 

4.4.2 细胞来源

 

作为先决条件，用于血管重建的细胞应该是非免疫原性的、能够增殖产生大量细胞、易于收获、并保留与天然血管中的内皮细胞的功能。

 

4.4.2.1 成人EC

 

内皮细胞在组织工程和再生医学中具有重要意义。然而，由于供体的多样性、分离的技术挑战、增殖能力有限、衰老和异质性，其应用受到限制。细胞系，包括HUVEC和EA.hy926细胞，由于其相对容易获取、可以从医疗废物中非侵入性地获取，以及分离后的产量高，已被广泛用于脱细胞肝脏的再内皮化。这两种细胞类型都能够覆盖脱细胞肝脏的血管，在体外血液灌注过程中血小板粘附和血凝块形成显著减少，并表现出在猪体内移植后能够承受血流的能力。主要缺点是它们的免疫原性和难以用作自体内皮细胞来源。此外，HUVEC表现出植入不良、形成血管的能力有限以及在体内应用后无法长期存活。

 

4.4.2.2内皮祖细胞

 

内皮祖细胞(EPC)是源自骨髓的外周血循环细胞，约占所有血液单核细胞的0.01%，其中一些细胞存在于成人的脂肪组织中这使得能够从外周血、脂肪抽吸组织和骨髓中轻松分离出足够数量的自体EPC，为脱细胞肝脏的再内皮化在临床应用中具有良好的潜力此外，有报道称EPC比EC具有更高的血管生成潜力。周等人通过门静脉向脱细胞大鼠肝脏注入从大鼠骨髓中分离的EPC。经过3天的培养基灌注，重新接种的细胞覆盖了脱细胞肝脏内的血管结构。

 

4.4.2.3诱导性多能干细胞

 

iPSC-EC可以通过多种方法从不同的细胞来源产生，具有优异的增殖能力。当将人类iPSC衍生的EC注射到斑马鱼模型中时，它们可以形成血管并与宿主血管吻合。Takeishi等人将人类iPSC分化为iPSC衍生的血管EC，并将分化后的细胞重新接种到大鼠脱细胞肝脏中细胞植入支架的血管结构中，在类似器官的环境中表现出血管生成和抗凝相关基因和功能的增强表达。

 

4.5胆道重建

 

需要解决的挑战之一是在生物工程肝脏内重建功能性胆管系统。每天，健康的人类肝脏会产生约750毫升胆汁来帮助消化脂质，其中肝细胞是其分泌的主要贡献者，通过胆管传递到胆囊。

 

胆管细胞是胆管系统肝内和肝外管道的上皮细胞，通过跨膜分子参与胆汁的形成、修饰和运输。虽然这些细胞仅占肝细胞总数的约3%–5%，但它们对于维持不同的正常生理过程是必不可少的。此外，胆管细胞充当细胞毒性胆汁和周围组织之间的主动屏障。因此，在生物工程肝脏内重建胆管网络的肝内和肝外胆管对于构建功能齐全的肝脏器官和避免移植后并发症严重的肝损伤至关重要。幸运的是，通过扫描电子显微镜、腐蚀铸型、染料灌注和造影剂射线照相术证实胆管网络树在脱细胞后完好无损；只需用胆管细胞重建即可。

 

虽然已有多项研究报道了用肝细胞对去细胞化的肝脏进行再细胞化，但用胆管细胞对胆管进行再填充的试验却寥寥无几。这可能是由于很难分离到足够数量的胆管细胞，胆管细胞在经过几次传代后会发生脱分化，在繁殖过程中会丧失功能和表型，以及胆道网络结构曲折复杂。

 

4.5.1 细胞来源

 

4.5.1.1 原代胆管细胞

 

Chen等人通过胆管注入原代胆管细胞、通过门静脉注入肝细胞，对脱细胞大鼠肝脏进行再细胞化。重要的是，他们报告说，脱细胞肝支架内的胆管系统几乎不透水，且最小胆管末端封闭，使得注入肝外胆管的任何液体都能保留下来，而不会扩散到实质中。因此，他们注入的胆管细胞量仅足以填满胆管，然后进行1小时的静态培养，使胆管细胞附着在胆管上。经过48小时的动态灌注后，他们观察到胆管上皮细胞形成管道状结构，而活肝细胞团则位于实质空间中，其排列方式模仿天然组织。有趣的是，与仅由肝细胞重新接种的脱细胞肝脏相比，用胆管细胞和肝细胞重新细胞化的支架显示出略高的累积白蛋白生成和尿素分泌水平。

 

4.5.1.2 胎儿肝肝母细胞

 

胎儿肝成肝细胞已被用作原代胆管细胞的替代品。Baptista等人证明了脱细胞肝脏能够诱导胎儿成肝细胞分化为胆道和肝细胞谱系此外，Ogiso等人还证实，存在器官特异性细胞-ECM通讯，这种通讯可增强脱细胞大鼠肝脏中重新植入的胎儿肝细胞成熟为肝细胞和胆管细胞谱系，而无需在7天的动态灌注期间向培养基中添加任何促分化信号。

 

4.5.1.3 类器官

 

最近，类器官技术因其能够分化、自组织和增殖，且具有高效稳定的性能，同时又不丧失理想的胆管细胞表型，在再生医学领域显示出了巨大的前景。这使得类器官成为胆管树重建的有吸引力的细胞来源。2015年，Huch等人首次描述了从人类肝活检中建立胆管细胞类器官。他们利用EpCAM从导管EpCAM+导管细胞中分选出肝细胞(EpCAM-)，并报告这些EpCAM+细胞发育成类器官的效率为28.4%。发育中的类器官表现出导管样表型，表达胆管细胞标志物(KRT7和KRT19)和祖细胞干细胞标志物(Sox9和LGR-5)，具有高增殖能力。在此研究之后，已证明可以从肝外胆管、胆囊和胆汁中成功生产类器官这些类器官表现出胆管系统内不同来源的胆管细胞之间的转录组和表型差异。

 

Tomofuji等人通过用肝导管类器官重新植入大鼠脱细胞肝脏，重建肝内胆管体外培养灌注3-5天后，重新植入的类器官沿胆管壁植入，重建具有管腔结构的胆管树状网络，并表达胆管细胞标志基因(图5)，包括KRT19、Sox9、CFTR和Hnf1b，并维持干性标记物(Lgr5、Prom1)的表达。这些研究共同证明，肝内来源、肝外来源和胆汁来源的器官组织可以有效地重新填充脱细胞胆管，同时保留与体内原发性胆管细胞非常相似的基因表达谱。

 

 

5.移植模型

 

体外评估和离体血液灌注系统使研究人员能够研究重新植入的肝细胞和胆管细胞的功能，以及肝支架内皮的完整性。然而，体内移植研究在监管层面上至关重要，因为它不仅要评估上述参数，还要评估潜在的炎症和/或免疫反应，更重要的是，还要评估生物工程肝脏的临床应用可行性。肝脏去细胞化后保留的血管结构使小鼠、大鼠和猪有机会通过将移植物连接到受体血管，异位或原位移植生物工程肝脏。通常，肝支架中的门静脉和肝下IVC分别连接到主动脉和IVC或肾动脉和肾静脉。

 

5.1 啮齿动物模型

 

啮齿动物对于评估再生细胞的存活和功能、生物工程肝脏的凝血性和免疫原性非常有用，而且比大型动物更受欢迎，因为它们易于繁殖、饲养、成本更低且符合伦理道德。在过去的十年中，多个研究小组报告了将去细胞化的雪貂、小鼠和大鼠肝脏植入同种异体啮齿动物体内，并植入有/无内皮细胞的肝细胞。Uygun等人将去细胞化的大鼠肝脏植入原代大鼠肝细胞。他们进行了单侧肾切除术，并将移植的肝门静脉和肝动脉分别与受体的肾动脉和肾静脉吻合8小时。支架内的再植细胞能够保持功能、正常形态和支架内实质的位置。

 

在支架移植前诱发急性或慢性肝衰竭是了解生物工程肝脏全部功能的另一个重要步骤。Bao等人对大鼠肝脏进行了去细胞处理，逐层进行肝素沉积，并在支架上重新植入肝细胞。他们将支架移植到90%肝切除大鼠的门户系统，持续72小时。与90%肝切除相比，移植的支架改善了肝功能，降低了血氨水平，并延长了存活时间。

 

Kim等人将纳米氧化石墨烯交联生物工程大鼠肝脏移植到分别由70%部分肝切除和硫代乙酰胺诱导的肝衰竭小鼠模型中。该模型使作者能够验证支架的体内再生能力。啮齿动物作为模型的缺点是腹部空间不足，阻碍了整个肝脏的移植。因此，这些研究仅在单侧肾切除术后移植了一个或几个肝叶。此外，虽然啮齿动物模型可以初步预测移植肝脏内的细胞功能、血管通畅性和移植物免疫原性，但由于大小和解剖结构上的差异，此类动物模型的研究结果通常无法应用于人体临床。

 

5.2 大型动物模型

 

一般而言，猪的肝脏是首选，因为它们的肝脏在大小、解剖学和生理学等许多方面都与人类肝脏相似。因此，通过该模型，可以更现实地评估生物工程肝脏的功能、潜在的血栓形成性和免疫反应，以及支架抵抗正常门静脉血流和压力产生的剪切应力以及手术并发症的能力。单侧肾切除术为移植一个叶或整个生物工程肝脏提供了空间。由于不同的研究人员使用人类细胞对支架进行再细胞化或再内皮化，因此需要使用免疫抑制剂。Barakat等人将猪去细胞右侧肝叶辅助移植到受体猪体内，并用甲基强的松龙进行免疫抑制。生物工程肝叶分别使用受体门静脉和肝下腔静脉作为流入和流出，植入肝下空间，据报道在移植2小时内保持支架的完整性。Hussein等人用EA.hy926内皮细胞对脱细胞猪右侧肝叶进行再内皮化，然后用HepG2细胞重新接种肝叶。他们将生物工程化的肝叶异位移植到猪体内1小时，并报告说，对比X光检查发现血管树通畅，凝血标志物表达下调，肝素-明胶预涂层肝支架中的肝功能表达增加。这项研究表明肝素明胶涂层在提高再内皮化效率和维持体内实质细胞功能方面是有效的。

 

我们研究小组通过脾切除术和甲基强的松龙给药在受体猪中诱导免疫抑制，然后移植用HUVEC重新内皮化的脱细胞肝脏，如图所示图6。我们观察到，与未进行免疫抑制的组相比，免疫抑制导致免疫反应显著降低，移植物灌注时间更长，移植物血管通畅时间超过14天。有趣的是，随着免疫抑制的停止，移植物血栓形成的发生率与非免疫抑制组相似，这表明针对HUVEC的异种免疫反应在血栓形成和移植物损失中起着关键作用。更进一步的是，在另一项研究中，我们成功地将原代猪肝细胞重新接种到之前用HUVEC重新内皮化的脱细胞肝支架上。我们通过结扎原生门静脉和肝动脉，原位切断原生肝脏的血管。然后，将生物工程肝脏植入原生肝脏尾部的辅助位置。生物工程肝脏内重新植入的肝细胞具有功能性，能够产生白蛋白、解毒氨并合成尿素，最长可达48小时。

 

Higashi等人将去细胞化肝脏的右侧叶重新植入原代肝细胞和内皮细胞。通过脾切除术以及免疫抑制药物(包括噻氯匹定、泼尼松龙和他克莫司)诱导受体猪的免疫抑制，并在术后期间进行免疫抑制。然后，将支架移植到60%肝切除的猪体内，作为诱导肝衰竭模型，持续28天。重要的是，除了作为抗凝剂的肝素外，动物还接受了阿司匹林和噻氯匹定以防止血小板聚集。生物工程支架显示出良好的肝细胞移植再植效果，肝功能得到改善，并表现出肝特异性基因的上调。值得注意的是，这项研究首次记录了生物工程肝移植在临床前大型动物模型中移植后28天的分析结果。

 

 

 

6. 监管措施

 

到目前为止，FDA还没有专门针对通过脱细胞和再细胞化方法联合生产的生物工程肝脏器官的使用的具体指导方针。涉及再细胞化组织使用的监管将与脱细胞组织相关的监管类似，但会有一些针对细胞重新引入的额外因素。一般来说，这些生物工程肝脏的使用将受到与医疗器械、生物制剂、人体细胞、组织以及细胞和组织基产品(HCT/P)相关的更广泛的FDA监管。

 

首先，使用人类/动物肝脏以及人类细胞进行细胞再生的知情同意和伦理考虑必须符合监管准则。其次，去细胞器官的制造必须符合《药品生产质量管理规范》(GMP)的规定，以确保去细胞后组织的质量、安全性、一致性和有效性。在去细胞化肝脏支架中为有毒的去细胞化试剂设定可接受的限度对于遵守FDA法规至关重要。由于存在活细胞，因此实现绝对无菌可能并不可行，但严格的质量控制措施(包括对残留污染物的评估和监管)对于确保用于再细胞化和后续临床应用的去细胞化肝脏的安全性和有效性至关重要。第三，对去细胞化器官进行再植会带来额外的复杂性和安全考虑。因此，监管机构需要详细的细胞来源信息，包括捐赠者筛查以防止传染病的传播、完整的细胞特征描述、再细胞化过程的验证以及再细胞化器官内细胞存活性和功能的证据。对再植细胞和去细胞ECM的免疫原性和兼容性的评估对于确保细胞的适当整合至关重要。第四，临床前和临床试验对于提供安全性和有效性的额外证据至关重要。

 

7. 结论和未来展望

 

肝脏组织工程正在迅速发展，其宏伟目标是彻底改变肝病学和肝移植领域。最近，三维生物打印已成为一种有前途的组织和器官构建技术，可用于药物筛选和潜在移植。Barranger等人利用CometChip技术构建了HepaRG人肝细胞的3D模型，促进了毒理学和疾病研究。同样，Vernetti等人率先提出了一种自组装肝脏模型，用于生理、药物安全和疾病研究此外，多项研究还探索了单独使用脱细胞肝生物墨水或将其与其他材料结合用于肝脏结构的3D生物打印。该技术由于其精确的控制和在复杂结构中均匀分布细胞的能力而表现出巨大的潜力。然而，肝脏生物打印在可移植的全功能肝器官中的应用仍处于起步阶段，需要进一步广泛的开发和扩展。本综述重点介绍了通过脱细胞和再细胞化生产肝移植物，特别是哺乳动物肝脏(人、猪)，因为该方法具有优越的可扩展性和临床应用潜力。

 

自Uygun等人开创肝脏脱细胞与再细胞化技术以来的14年间，灌注脱细胞/再细胞化技术取得了重大进展。这一进展使得能够创建具有完整血管内壁的临床相关的脱细胞/再细胞肝支架，为再生医学带来希望。尽管取得了这些进展，但将生物工程肝支架过渡到临床移植试验仍面临若干挑战，需要进一步研究和开发。此外，这些生物工程肝脏可以作为开发能够暂时支持肝功能衰竭患者肝功能的设备的支架。例如，临床试验“Miromatrix外部肝脏辅助产品(miroliverELAP®)对急性肝功能衰竭成人肝脏支持的1期前瞻性研究”目前正在研究miroliverELAP®系统(一种体外支持的生物人工肝系统)在治疗急性肝衰竭方面的疗效。

 

脱细胞肝支架的免疫原性仍然是主要问题，特别是由于在未使用免疫抑制的大型动物模型中的研究有限。免疫抑制药物的使用，加上缺乏对生物工程肝脏的体内长期评估，导致对ECM免疫原性的研究不切实际。尽管如此，FDA批准了来自各种来源(例如人真皮和肺动脉瓣、猪小肠、膀胱和真皮以及牛心包产品)的各种脱细胞组织支架用于临床，表明在克服免疫相关问题方面取得了进展。这些支架的临床批准凸显了这些脱细胞组织在支持人体组织再生方面的安全性、有效性和生物相容性，解决了人们对脱细胞ECM潜在免疫反应的担忧。不同实验室的脱细胞方案各不相同，导致不同方案产生的肝脏成分也不同。因此，脱细胞技术和质量评估的标准化，以确保支架内不含任何细胞毒性剂以及消除异种和致病表位，以分别解决潜在的宿主免疫反应和人畜共患病问题，是满足实验和临床应用标准所必需的另一项挑战。

 

在去细胞支架中重新植入功能性肝细胞至关重要。目前，已有多种技术和细胞类型被用于肝脏支架的再植。原代肝细胞的使用已经显示出可重复性，但仅显示出初步的重要功能迹象，例如在我们的一个体内研究中血清氨的暂时稳定。由于具有独特的性质和潜在的治疗功效，间充质干细胞和诱导性多能干细胞在临床应用方面具有重大前景。

 

重建完整且有功能的内皮细胞层也面临挑战，需要制定微毛细血管重建和均匀内皮细胞覆盖的策略。最后，胆道系统的重建和各种细胞类型的重新分布仍未得到解决，这凸显了实现全功能肝脏替代品的复杂性。

 

未来的工作还必须解决后勤方面的挑战，例如器官可用性、仪器要求、成本考虑以及监管审批，以促进更广泛的临床转化。合作研究有望彻底改变肝脏再生和移植，为需要救命干预的患者带来希望。

 

原文信息

 

The title of the article is “Liver tissue engineering using decellularized scaffolds: Current progress， challenges， and opportunities”.

 

DOI:10.1016/j.bioactmat.2024.06.001