摘  要 / Abstract

 

为探究糖脂协同抑制马拉色菌活性的效果，采用Box -Behnken 设计( Box -Behnken design,BBD)响应面优化法，使用Design -Expert 软件优化模拟以糖脂（A）、迷迭香叶水（B）、侧柏叶提取物（C）为去屑组合物，探究组合物的配比对马拉色菌抑菌率的影响。结果显示，单因素间对抑菌率的影响程度为A≈B>C，而两两因素相互间交互影响大小为AB>AC>BC。在最佳条件组合下（47%糖脂、28%迷迭香叶水、8%侧柏叶提取物），抑菌率为96.50%。植物提取物在特定比例下（迷迭香∶侧柏= 25.8 ∶12.8），糖脂与植物提取液联用时，协同联合作用指数（CI）为0.4795，表现出显著的协同抑制效应。将此优化的去屑组合物添加于头皮去屑精华液中，有效抑制马拉色菌生长P<0.05），验证了其优良的去屑功效。

 

In order to explore the effect of glycolipids on the synergistic inhibition of Malassezia, the Box-Behnken design (BBD) response surface optimization method and the Design-Expert software were used to optimize and simulate the anti-dandruff composition of glycolipids (A), Rosmarinus officinalis leaf water (B), and Platycladus orientalis leaf extract (C), The effect of the ratio of these components on the inhibition rate of Malassezia was investigated. The results showed that the influence of individual factors on the inhibition rate was A≈B>C, while the interaction between two factors followed the order AB>AC>BC. Under the optimal combination of conditions (47% glycolipids, 28% Rosmarinus officinalis leaf water, 8% Platycladus orientalis leaf extract ), the inhibition rate was96.50%. When the plant extracts were combined at a specific ratio Rosmarinus officinalis leaf water ∶Platycladus orientalis leaf extract =25.8 ∶12.8), the synergistic combination index (CI) was 0.4795 when glycolipids were used in combination with the plant extracts, indicating a significant synergistic inhibition effect. This optimized anti-dandruff composition was ther added to a scalp anti-dandruff essence, which effectively inhibited the growth of Malassezia (P<0.05), confirming its excellent anti-dandruff effect.

 

关 键 词 / Key words

 

糖脂；马拉色菌抑菌率；响应面法；协同联合作用指数；去屑

 

glycolipids; Malassezia inhibition rate; Box-Behnken Design; synergistic combination index; anti-dandruff

 

马拉色菌被认为是头皮屑感染的主要致病微生物[1]。该真菌通过马拉色菌脂肪酶LIP1（SMG1）增殖，这种酶在脂质代谢过程中产生不饱和的游离脂肪酸（free fatty acids，FFAs）。FFAs参与了真菌的致病性，诱导皮肤炎症、瘙痒、表皮细胞过度增生，最终造成头屑[2-3]。

 

目前，化妆品中常用的去屑剂为吡硫鎓锌、吡罗克酮乙醇胺盐、氯咪巴唑、二硫化硒、水杨酸等。但这些物质具有一定的致敏性、刺激性和不稳定性，其效果不可预测，易出现副作用[4]。去屑剂的种类不仅决定去屑效果优劣，而且对消费者的健康和安全也有一定的影响[5]。

 

糖脂是由非致病性酵母菌产生的可降解的天然生物表面活性剂[6]，其具有独特的生物活性[7]，在糖类生物表面活性剂中，具有应用潜力[8]。糖脂通过β-1，2-糖苷链与C16—C18的羟基脂肪酸链连接，以酸型和内酯型两种形式存在，因其具有抗菌、抗病毒等活性，广泛应用于制药、化妆品、公共卫生及农业领域[9-10]。

 

植物抑菌剂作为一种纯天然绿色抑菌剂，主要是起到抑制微生物细菌繁殖的作用，在实际应用中范围较广。植物抑菌剂以其刺激性小、安全性高的优势，受到了社会各界的广泛关注[11]，为化妆品行业开发新型安全高效绿色的去屑活性成分提供研究思路。

 

1、实    验

 

1.1 材料

 

迷迭香叶（亳州市迎真堂药业有限公司，批号20220727）、侧柏叶（亳州市迎真堂药业有限公司，批号20220139）；糠秕马拉色菌（广东省环凯微生物科技有限公司，型号GDMCC2.181）；马拉色菌培养基基础（Leeming-Notman agar Modified，MLNA）（山东拓普生物工程有限公司，批号20220919）；0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）（青海博生物技术有限公司，批号2022052301）；六水合氯化镁（国药集团化学试剂有限公司，批号20221421）。

 

熊蜂生假丝酵母（上海保藏生物技术中心，ATCC 22214）；酵母霉菌琼脂（Yeast Mold Agar，YM Agar）（上海瑞楚生物科技有限公司，批号20220720）；酵母霉菌肉汤（Yeast Mold Broth，YM Broth）（上海瑞楚生物科技有限公司，批号20220726）；葡萄糖（西安药业有限公司，批号20220815A），酵母粉（安琪酵母股份有限公司，FM802，批号2022081501B5），磷酸二氢钾（KH2PO4）（上海麦克林生化科技股份有限公司，批号P815662-500g），无水硫酸镁（MgSO4）（西陇科学股份有限公司，批号210601-2），氯化钠（NaCl）（湖北蓝天盐化有限公司，批号20220524），无水氯化钙（CaCl2）（西陇科学股份有限公司，批号220412-1），蛋白胨（安琪酵母股份有限公司，FP103，批号2022070401B1），菜籽油［嘉吉粮油（南通）有限公司，批号20220620］。

 

1.2 仪器

 

KBF240恒温恒湿培养箱（德国宾德有限责任公司）；BSC-1604 Ⅱ A2生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；CL-32L高压灭菌器（日本ALP）；SQL1010C高压灭菌锅（重庆雅玛拓机械制造科技有限公司）；DW-25L262低温冰箱（海尔公司）；VXR Basic小型震荡器（德国艾卡公司）；T&J-Intelli-Ferm A 10L发酵罐[迪必尔生物工程（上海）有限公司]；SBA-50B+生物传感分析仪（山东省科学院生物研究所）；ME3002E电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；Design-Expert10.0.7软件。

 

1.3 实验方法

 

1.3.1 糖脂制备

 

首先挑取熊蜂生假丝酵母菌株在YM 固体培养基上平板划线活化/试管斜面，30℃培养48h 进行菌株活化，获得单菌落，4℃试管保存留用。从平板上挑取单菌落接种至50ml YM 液体培养基中，在30℃、220rpm 条件下，摇床培养48h，作为种子液备用。向发酵罐中加入4L 发酵培养基（葡萄糖100g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4 0.076g/L，NaCl 0.1g/L，CaCl2 0.244g/L，蛋白胨0.7g/L，菜籽油50g/L，溶剂为无菌水）和适量种子液进行发酵，每8 小时监测一次葡萄糖和菜籽油含量，当葡萄糖浓度低于20g/L、油脂含量低于10g/L 时，补充葡萄糖和菜籽油，维持葡萄糖浓度在25~30g/L，菜籽油浓度在15~20g/L 范围内，发酵48h 后停止补充糖、油， 由其自行将葡萄糖、菜籽油消耗完全，96h 时结束。发酵结束后，将发酵罐升温至60℃，维持20 ~30min 使酵母菌失活。分离收集底部棕黄色油状黏稠状糖脂，加入等体积55 ~65℃温热的蒸馏水混匀，以洗掉剩余的亲水杂质，并再次加热55 ~65℃以促进水和糖脂之间的分离。静置分层，取下层油状产物，上层水相可合并菌液层一同处理。重复水洗2~3 次，以得到澄清棕黄色黏稠状糖脂，25℃保存备用[12]。

 

1.3.2 迷迭香叶水制备

 

取适量干燥迷迭香叶药材，磨成40 ~80 目的细粉，将迷迭香叶药材和水按质量配比1∶4 投入回流罐中，95℃加热回流，从水开始回流计算时间，提取时间为2.5h，回流完成后过滤并收集提取液，合并提取液，得到淡棕色透明液体，备用。

 

1.3.3 侧柏叶提取物制备

 

取适量干燥侧柏叶药材，磨成40 ~ 80 目的细粉，将侧柏叶药材和水按质量配比1∶4 投入回流罐中，95℃加热回流，从水开始回流计算时间，提取时间为2.5h，回流完成后过滤并收集提取液，合并提取液， 得到淡棕色透明液体， 固含量在3%~5%，备用。

 

1.3.4 组合物对马拉色菌抑制率的测定

 

采用悬液定量法测定样品马拉色菌抑菌率。取0.1ml 糠秕马拉色菌（GDMCC2.181）悬浮液，滴入装有5.0ml PBS 试管内， 回收菌数为1 ×104~9 ×104 cfu/ml，制备马拉色菌稀释液，备用。

 

取5.0ml 试验样品原液放入灭菌试管中， 在20℃条件下，恒温5min。恒温结束后，将0.1ml马拉色菌稀释液加入到试管中，迅速搅匀，并立即计时，作用时间为5min。计时结束后，取0.5ml马拉色菌和样品混合液，加入到经灭菌装有4.5mlPBS 试管中，充分混匀；继续放置10min 后，吸取样液1ml 置于灭菌平皿内，每个样液接种两个灭菌平皿，向平皿内倾注15ml、40 ~ 45℃的Leeming -Notman 培养基基础，转动平皿，使其充分均匀，待Leeming -Notman 培养基基础凝固后翻转平皿，在28℃培养7 天后，做活菌菌落计数。以PBS 代替试验样品，同时按以上步骤操作，作为对照样品。实验重复三次，按照公式①计算平均值。其中，Ⅰ为对照样品平均菌落数，Ⅱ为试验样品平均菌落数。

 

 

1.3.5 组合物马拉色菌抑菌活性优化响应面分析

 

依据文献[13 -15]，通过对组合物进行马拉色菌抑菌活性实验，以单因素实验结果为基础，选取糖脂（A）、迷迭香叶水（B）和侧柏叶提取物（C）为考察因素，以抑菌率为响应值，进行三因素三水平响应面法Box -Behnken 设计（Box -Behnken design，BBD），优化组合物的最佳抑菌配比，优化各因素水平见表1。

 

 

1.3.6 糖脂协同联和作用指数（CI）的测定

 

依据文献[16]，化合物联合作用指数分析，采用中效原理计算。按照公式②计算两化合物联合作用指数。

 

其中，D1 为化合物１与别的化合物联合作用产生Ｘ效应时所需的浓度；D2为化合物2与别的化合物联合作用产生Ｘ效应时所需的浓度；（DX）1为化合物１单用产生Ｘ效应时所需的浓度；（DX）2为化合物2单用产生Ｘ效应时所需的浓度。

 

每组实验重复3 次，求平均值。计算 CI 值，以 CI 值为判定标准， CI ≤0.7 为较强协同作用；0.7< CI＜0.9 为协同作用；0.9＜ CI＜ 1.1 为相加作用；CI＞1.1 为拮抗作用。

 

1.4 在去屑化妆品中的应用

 

将A 相预混均匀，加入B 相，搅拌混合均匀，取样检测合格后，出料即得头皮去屑精华液样品。将配方中的去屑组合物以去离子水代替，按照相同的方法制得头皮去屑精华液对照样。配方组成详见表2。

1.4.1 样品马拉色菌抑菌率测试

 

根据1.2.4 测试马拉色菌抑菌率的方法，分别测定头皮去屑精华样品和对照样品在不同作用时间内对马拉色菌抑菌率，以评估产品去屑效果。

 

1.4.2 人体去屑功效测试

 

招募志愿者使用上述样品。入选标准：明显可见头皮屑，头皮油脂分泌旺盛者。排除标准：① 头部有湿疹、银屑病、头癣、石棉样糠疹或明显脂溢性皮炎等头皮皮肤病者；② 30 天内参加药物临床试验或其他试验者；③ 1 个月内有外用或内服抗真菌药物或糖皮质激素者。

 

基本情况：共纳入30 例受试者，男女各一半，年龄介于20 ~ 51 岁之间，分2 组，15 人/组，每组男女比例相同，分别使用上述头皮去屑精华液样品和对照样品。使用频率为每天早晚各使用一次，且不能使用其他头皮护理产品，也不进行任何头发美容行为。分别于使用测试产品1、2、3 周和4 周对去屑效果进行评价打分，评级标准如表3 所示。

1.4.3 统计学方法

 

利用SPSS 27.0 统计软件进行数据处理分析，组内比较采用配对 t 检验，组间比较采用独立样本t 检验，P<0.05 表示结果具有统计学差异。统计结果通过对马拉色菌抑制率和头屑改善情况说明天然去屑组合物的去屑功效。

 

2、分析和结果

 

2.1 组合物马拉色菌抑菌活性优化响应面分析

 

2.1.1 回归模型建立

 

选取马拉色菌抑菌率（Y）为响应值，Box -Behnken设计（Box -Behnken design，BBD）实验结果详见表4。其中-1、0、1 分别代表自变量的低、中、高水平。进一步对回归模型进行方差分析，结果详见表5。

 

在BBD 实验中组合物对马拉色菌的抑菌率为89.5% ~98.7%，见表4。采用Design -Expert 10.0.7 软件进行方差分析结果显示 F值为187.07，P＜0.0001，详见表5，证明模型极其显著且误差小；失拟项不显著（P＞0.05），表明残差源于随机误差。决定系数 R2 =0.9959（R2＞0.9 显示预测值与实测值高度相关），调整后的 R2adj =0.9905，说明模型预测性能优良，各组分对抑菌率的预测与实际结果吻合度高，且两者间存在显著关联性，进一步验证了模型的有效性。一次项A、B、C 及二次项A2、B2、C2 以及交互项AB、AC 对抑菌率的影响均具有统计学显著性（P＜0.05），见表5；其中一次项和二次项的影响均为极显著（P＜0.001），表明因素A、B、C 对抑菌率有显著的非线性效应。特别是交互项AB、AC 对马拉色菌抑菌率影响显著（P＜0.05），说明各因素与响应值间并非简单的线性关系，而是复杂的非线性联系。影响马拉色菌抑菌率因素大小顺序为A≈B>C。其中糖脂和迷迭香叶水两因素相交作用AB 对马拉色菌抑菌率影响达到极显著水平（P＜0.0001）。影响马拉色菌抑菌率因素大小顺序为AB＞ AC＞ BC。为了分析变量对马拉色菌抑菌率的影响，对表5 进行回归分析，得到关于马拉色菌抑菌率（Y）二次多项式回归方程为：Y=98.42+1.65A+0.76B+0.79C-1.87AB+0.52AC+0.1BC-2.89A2-1.76B2-3.41C2

 

2.1.2 各因素交互作用分析

 

通过Design -Expert 10.0.7 软件分析线性回归方程，可绘制出响应面图和等高线图。各因素交互作用对马拉色菌抑菌率的影响，见图1。曲线陡峭程度和等高线稀疏密集程度反应了组合物中两两因素间相互作用对马拉色菌抑菌率影响的显著性。

 

 

 

由图1a 可知，在迷迭香叶水添加量相同时，随着糖脂添加量从30g 升高到40g，马拉色菌抑菌率显著升高；当添加量超过40g 后， 抑菌率开始下降。由于糖脂具有表面活性，可以提高迷迭香和侧柏叶提取物中溶解性较差抑菌组分溶解性，最终形成混合胶束，胶束通过改变马拉色菌疏水表面，增加植物提取物中溶解性较差的酚类和萜烯类等抑菌组分穿过细胞膜，破坏细胞膜通透性和完整性，引起细胞内容物的渗透，达到抑制马拉色菌的作用。当超过一定量时，糖脂在水中溶解度降低，从而影响抑菌效果[17-18]。

 

在糖脂添加量相同时，随着迷迭香叶水添加量从10g 增加到20g，马拉色菌抑菌率缓慢升高；当迷迭香叶水添加量超过20g 后，马拉色菌抑菌率缓慢下降，表明参数之间存在二次函数关系和拮抗作用。在迷迭香叶水添加量超过20g，糖脂添加量超过40g 后，导致马拉色菌抑菌率迅速下降。

 

侧柏叶提取物和糖脂添加量对马拉色菌影响见图1b，当侧柏叶提取物添加量在2% ~ 10%，糖脂添加量在30% ~50%时，马拉色菌抑菌率随着侧柏叶提取物或糖脂添加质量分数升高而呈现先升高后降低的变化趋势。

 

侧柏叶提取物和迷迭香叶水添加量对马拉色菌影响见图1c，当侧柏叶提取物添加量在2% ~10%，迷迭香叶水添加量在10% ~30%时，马拉色菌抑菌率随着侧柏叶提取物或迷迭香叶水添加质量分数升高而呈现先升高后降低的变化趋势，但侧柏叶提取物和迷迭香叶水两者相互作用的等高线接近圆形，表明交互作用不显著，对马拉色菌抑菌率影响不显著。

 

采用Design -Expert 10.0.7 软件进行参数优化，最大限度的提高马拉色菌抑菌率，得到最佳抑菌条件为糖脂47.29%、迷迭香叶水28.31%、侧柏叶提取物8.8%，此条件下抑菌率为95.65%。考虑到实际操作情况，调整糖脂为47%、 迷迭香叶水28%、侧柏叶提取物8%，进行三次重复试验，得到马拉色菌抑菌率平均值为96.50%，说明该模型具有良好的拟合性。

 

分别测定最佳抑菌率组合物中47% 糖脂和36%植物提取液（28% 迷迭香叶水+8% 侧柏叶提取物）的马拉色菌抑菌率结果，见图2。糖脂和植物提取液联合使用时具有显著抑制马拉色菌的作用（P＜0.01）。

 

2.2 糖脂协同联合作用指数（CI）的测定

 

进行糖脂和植物提取液联合作用指数测定，其中植物提取液组分配比为迷迭香叶水和侧柏叶提取物的质量比为28 ∶8。分别测定马拉色菌抑菌率为50%时，糖脂和植物提取液单独和联合使用时，各组分质量浓度，详见表6。

 

根据计算公式计算表1 中组分联合作用指数的CI 值，得出：CI50 =0.4795，可知糖脂和植物提取物按照质量百分比为25.8 ∶12.8 复配时，具有协同抑制马拉色菌的效果，协同作用较强。

 

2.3 去屑功效测试

 

马拉色菌抑菌率测试结果见图3 和图4。未添加去屑组合物的对照组头皮去屑精华液对马拉色菌抑制效果微弱，无明显变化，无抑菌效果；添加去屑组合物的样品组头皮去屑精华液，抑制马拉色菌效果显著（P＜0.05）。说明添加去屑组合物的头皮去屑精华具有显著抑制马拉色菌作用，具有去屑功效。

 

 

 

人体去屑功效测试结果见图5 和图6。通过人体功效评价测试，连续使用头皮去屑精华液4 周，对照组样品改善头屑情况无明显效果；样品组头皮去屑精华液，改善头屑情况显著（P＜0.05）。说明添加去屑组合物的头皮去屑精华液具有改善头屑、去屑功效。

 

 

 

 

3、结    论

 

本文以糖脂、迷迭香叶水、侧柏叶提取物为组合物，采用Box -Behnken Design（BBD）响应面优化法，以马拉色菌抑菌率为衡量指标，得到组合物最佳抑菌配比条件。当糖脂和植物提取液联合使用时，表现出显著的协同抑制效应，且协同作用较强。添加去屑组合物的头皮去屑精华液，在人体去屑功效评价测试中具有良好的去屑效果（P＜0.05）。以糖脂、迷迭香叶水、侧柏叶提取物为去屑组合物时，对马拉色菌协同抑制作用较强，效果较理想，且在头皮去屑精华液产品中应用达到预期效果，具有实际应用价值，为化妆品行业开发新型、高效、安全的绿色去屑剂提供了有力的数据支持和技术指导。

 

对于糖脂抑菌性能研究，国内外多数集中于其本身对革兰阳性菌的抑制效果，目前对马拉色菌抑制作用尚未报道。与其他物质联合应用是研究糖脂抑菌性能的新思路，由于目前仅停留在初始研究阶段，协同抑制机理尚不明确，仍有许多问题待解决。

 

引用本文

 

李丹,陈彩凤,林星宇,陈殿松,马铃.糖脂协同抑制马拉色菌活性研究及其在化妆品中的应用[J/OL].《化妆品与皮肤科学》网络专刊,2024(2):16-25[2024-11-22].https://www.cfdam-health.com/ebook/hzp/202402/index.html.