目前常用的细胞毒性测定方法有MTT法和CCK-8法，相较于MTT法，cck-8法具有无毒性、效率高等优点而被广为使用。今天介绍一下cck-8法的实验步骤及操作技巧。

CCK-8法的原理

CCK-8全称Cell Counting Kit-8，是一种基于WST-8的应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测试剂盒。其工作原理为在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8这一物质可以被线粒体脱氢酶还原成橙黄色的甲臜产物，且其颜色深浅与细胞增殖程度成正比，与细胞毒性程度成反比。

实验步骤

1）制备细胞悬液：若为悬浮细胞则直接离心收集对数生长期的细胞；若为贴壁细胞则用胰酶消化后离心收集细胞。将收集到的细胞用含血清培养基重悬后，用血细胞计数板计数，再稀释为5×10^3~5×10^4个/ml的单细胞悬液。

2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔100μl，同时设计不同的浓度组，每个浓度组可设计3~6个复孔，且设置好空白组和对照组。

3）将培养板放入培养箱中预培养24h左右（37℃, 5%CO2）。

4）向培养板各孔中加入不同浓度的待测物质（药物、化学试剂等）放入培养箱中孵育6~96h。

6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀（防止因CCK8试剂沾在孔壁上而带来的误差），加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。

7）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。

8）用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。

注意事项

（1）接种细胞数：针对标准96孔板，贴壁细胞的最小接种量为1000个/孔 (100μl培养基)。若为白细胞，接种量不低于2500个/孔 (100μl培养基)。若使用24孔板或6孔板，应预先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

（2）在细胞毒性实验中，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。

（3）在培养箱中孵育期间，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，造成体积不准确，从而增加误差，因此，建议最外一圈的孔只加PBS，不作为测定孔用。

（4）加入待测物之后培养的具体时间6~96h要看待测物质的性质和细胞的敏感性，例如6、12、24、48h。实验时可以选择不同作用时间下进行细胞毒性检测。

（5）如果待检测物质有氧化性或还原性，在加入CCK-8之前要更换新鲜培养基，以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

（6）正常显色时间为1-4h，可以每半小时测定一次OD值，使其OD值保持在1-2之间后固定显色时间重复实验。

（7）因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞需要较长的显色时间（5-6h）。

（8）测定波长：如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm，建议选650nm。

（9）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温避光保存， 24h内测定OD值不会发生变化。

（10）新鲜的CCK-8试剂为粉红色，储存时间过长则颜色加深、效率变低，最好不使用。通常情况下CCK-8试剂在0-5℃避光条件下可保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

常见问题

为什么复孔之间的重复性不好？

（1）可能在接种细胞时不小心带入了气泡。为避免这种情况，应及时更换枪头，且沿着侧壁将细胞悬液加入96孔板中，避免枪尖在打液的过程中插入液面下方从而产生气泡。若已经产生气泡，可用1ml注射器针头烧热后将气泡戳破减小误差。

（2）可能是在换液过程中将贴壁的细胞滑散了。为避免这种情况请在细胞贴壁后注意沿侧壁底面利用枪头的虹吸作用将孔内的培养基吸取出来。

（3）可能是在换液过程种没有将孔内的液体洗净就加入了新的培养基。

（4）可能是加入的CCK-8试剂微量没有加准。为避免这种情况，可以直接配制含10% CCK-8的培养基，以换液的形式加入96孔板中，每孔100μl。

计算方法

细胞抑制率 =（对照-实验）/（对照-空白）×100%

对照：具有细胞、培养基、CCK-8的孔的OD值

实验：具有细胞、培养基、CCK-8和药物溶液的孔的OD值

空白：具有培养基和CCK-8的孔的OD值