编者语：本文主要研究了不同形式的常用预灌封注射器对药液的影响，特别是对防腐剂含量的影响。研究表明，预灌封注射器的柱塞和针头护帽能够不同程度的导致产品中防腐剂和水蒸气的扩散及渗透，从而致使产品中防腐剂含量的降低。本文通过对预灌封注射器中产品稳定性、材料相容性、有机硅结合性研究、蒸汽渗透性、针头护帽/柱塞以及HS-GC-MS等研究，确定预灌封注射器的柱塞、针头护帽不仅对氧气有较高的透过率，而且对水蒸汽以及产品中BzOH的渗透性也影响较大。需要对容器封闭系统的物理化学性质具有一定了解和评估，从而降低在稳定性研究过程中遇到的不可预见的问题。另外，提示包材生产厂家可以通过涂覆惰性材料来提高产品稳定性。

摘要：预灌封注射器（PFS）是一种广泛使用的药物输送医疗器械，特别是用于生物来源性的药物。产品成分和PFS成分之间的相互作用在PFS的适用性方面起着至关重要的作用。含有苯甲醇/BzOH的稀释剂（以苯甲醇/BzOH为防腐剂）用于复溶冻干产物的PFS显示，在加速和强力稳定过程中发现BzOH含量系统性降低。为了了解和确定这一现象的根本原因，对该现象进行调查。BzOH与PFS的橡胶成分（塞子和尖端盖）结合的倾向各不相同。通过顶空-气相色谱-质谱（HS-GC-MS）分析研究了PFS尖端盖上的蒸汽渗透行为。根据橡胶组分的特性，BzOH不仅可以与之结合，还可以穿透它们，导致稳定性过程中在橡胶组分中的系统性损失。PFS不仅可以像以前的研究所示允许水蒸气渗透到尖端盖上，还可以允许像苯甲醇这样的有机化合物分子通过。这种现象强调了初级包装仔细选择组件的必要性，也提供了一个可以在早期选择最佳初级包装配置时部署HS-GC-MS等新型工具的机会。

关键词：预灌封注射器；BzOH；稀释剂；吸附；蒸汽渗透；针头护帽；柱塞；HS-GC-MS

1.    简介

随着生物技术治疗方法的出现，大量的单克隆抗体（mab）处于研究开发中。大约有40%的冻干单克隆抗体，最终呈现出粉末状（片状）的药品[1,2]。Gervasi等人最近报道，仅在欧盟，就有约34%的肠外蛋白配方是冻干的[3]。冻干粉可避免溶液介导的降解，确保产品在保质期内的稳定性[4,5]。冻干产品需要使用稀释剂/载体将冻干剂重组为肠外给药溶液。通常，稀释剂可以是注射用水或使用含有防腐剂的无菌水，这些防腐剂可以在规定的使用期限内提供微生物稳定的重组溶液。含BzOH的注射用水被广泛用作冻干蛋白的稀释液，多数为多用途小瓶。开发一种含有PFS的稀释剂，与冻干剂一起包装，在剂量方面具有优势准确性和患者安全性方面具有较好的优势，如用于重构的稀释剂用量得到了保证以及由于处理不同注射器之间固有可变性而导致的错误被最小化[7,8]。

使用PFS系统给药变得越来越重要，特别是对于那些需要反复或长期给药的药物[9]。推动PFS增长的主要因素是易于给药、给药准确以及与自动注射器具有兼容性，从而进一步提高了患者的依从性[10,11]。与小瓶相比，PFS设备的复杂性，给以PFS为基础的药品开发带来了技术挑战。然而，这些挑战通常以影响药品质量的形式反映出来（如：钨[12,13]/硅油诱导的聚集或颗粒形成[14-17]）或设备功能（如：针头堵塞、高断裂/滑动力等[18,19]），从而对产品质量和性能产生不利影响。最近有报道称，通过PFS针罩的蒸汽传输会导致含蛋白药物的针堵塞[20,21]。在选择药物制剂溶液和PFS组分之间的相互作用时必须考虑药品的主要容器。这不仅适用于高浓度、高粘度的生物制品，也适用于含BzOH的非生物制品。就PFS而言，BzOH不仅可以在小分子无菌制剂（如：Falsodex®）中作为防腐剂使用，也可用作蛋白质冻干液（如冻干剂）的稀释剂/载体的防腐剂成分（如：Extavia®和Enbrel®），以确保重组产品在持续时间（包括保持时间）内无菌，直到给完患者最后一剂产品。关于小分子和蛋白质肠外配方中使用防腐剂的详细概述可以在Brian及其同事发表的综述文章中找到[22]。

稀释剂PFS，作为我们其中一个项目技术开发稳定性计划的一部分，测试是在“加速条件”和“应力条件”（以及实时存储条件）下，而这些条件通常高于推荐的储存温度和相对湿度值。在这些研究过程中，观察到稀释剂注射器中BzOH含量的下降。而稀释剂中防腐剂含量的降低可导致含有潜在改变防腐剂的重组产品功效。这可能对此类产品的微生物质量产生深远的影响，特别是如果打算用于多次给药。PFS使用量的增加[23]，以及冻干生物制品数量的激增[24]，加速了对这一现象进行评估和调查的动力。在开发早期识别这种现象可以作为提供预期货架期的最佳初级包装组件的关键指标。

PFS 以基于固定针头和鲁尔接头的形式提供 (图1)。鲁尔接头格式可以基于“鲁尔滑动”(LS)，其中尖端盖可以简单地滑动/安装到注射器尖端(图1B)，也可以是“鲁尔锁”(LL)，其中旋转环驱动尖端盖安装/锁定到注射器尖端(承载环)(图1C)。用于低滑动注射器的尖端帽由弹性体/橡胶制成，而用于LL注射器的尖端帽通常由刚性塑料屏蔽(例如聚丙烯)内的弹性体/橡胶构成。LL和LS注射器可用于全球许多制药公司的应用[25]。弹性体合成橡胶和丁基热塑性弹性体通常是透气性的，其中这种透气性有助于PFS系统的灭菌(通过蒸汽或环氧乙烷)[26]。显然，这种渗透性也会导致注射器内部药品中的水蒸气通过针尖盖渗透到外部环境中[21]。我们将进一步说明这种现象不仅是水分子逃逸的原因，也是像BzOH这样的小分子逃逸的原因。在本篇研究性文章中，我们系统地研究了PFS中苯甲醇含量的降低，并表明稀释剂中含有的BzOH不仅可以与之结合而且可以透过PFS的针尖帽盖，在防腐剂的丢失过程中，不会伴随任何降解过程。

图1预灌封注射器普遍使用的规格 (A) 固定针头 PFS，(B) 鲁尔滑动 PFS，(C) 鲁尔锁 PFS

2.    材料与方法

2.1材料

BzOH购自Merck KGaA (Darmstadt, Germany)。使用Millipore-Q装置(Millipore，型号Advantage A10)制备的超纯水配制含BzOH的溶液(稀释剂)。Dow Corning® 360医用液(聚二甲基硅氧烷/硅油)，粘度为1000cST，购自道康宁(美国)。注射器编号1:2.25 mL LL-PFS样品由长2.25 mL、I型硼硅酸盐透明玻璃桶组成，指状法兰和尖端帽盖由合成异戊溴丁基弹性体橡胶混合制成，由塑料(聚丙烯)外壳屏蔽。注射器用特氟龙涂层(产品接触面)和溴丁基柱塞。注射器编号2:2.25mL LS-PFS样品由长2.25mL、I型硼硅酸盐透明玻璃桶组成，指状法兰和尖端帽盖由合成聚异戊二烯专有弹性体橡胶共混物制成。注射器用特氟龙涂层(产品接触面)和溴丁基柱塞。注射器(带瓶盖)和柱塞作为即用型(RU)组件从制造商处收到(清洗，硅化和消毒)。上述主要包装成分的物理化学属性信息可从各自制造商提供的分析/规范证书中获得。将含BzOH的溶液分别以10 mg/mL或9.7 mg/mL的浓度在去离子水中制备，过滤(0.2μm)，填充(1 mL)玻璃注射器，然后加上柱塞。当保持垂直(法兰向上)位置时，每个PFS在液体表面和注射器塞之间的目标顶空为5mm(限制：2~5 mm)。注射器灌装操作在层流控制环境下进行。本研究中使用的所有化学品均为药品级。特氟龙胶带(宽度：12mm；厚度：0.1 mm，货号：7500001008)购于德国Teguma GmbH。移液器、移液头(1ml)和注射器管(安全锁管1.5 mL)。编号：0030120.86)采购于德国Eppendorf。结合研究中使用的玻璃瓶采购自德国Schott-Duran®，由透明硼硅酸盐玻璃(EP/USP型I)制成，并配备具有密封性的蓝色聚丙烯盖。

2.2稳定性研究

稳定性研究作为稀释剂填充注射器(注射器1和注射器2)技术开发的一部分进行。两种类型的注射器在长期(5±3°C)、加速(25±2°C/60±5% RH)和强力(40±2°C/ 75±5% RH)储存条件下长达3个月，测试点分别为0、1和3个月。在每个稳定性条件的每个测试点对每种类型的一个稀释剂注射器进行测试。在指定的拔出点，拧开/取下尖端帽盖，用柱塞杆将稀释剂注射器的全部内容物(不使用针头)排出到1.5 mL Eppendorf管中。分析前，用1ml移液管将同物从Eppendorf管转移到高效液相色谱瓶中。

2.3采用高效液相色谱法测定BzOH

采用高效液相色谱法定量测定BzOH和杂质(苯甲醛和苯甲酸)的含量。该系统(Agilent LC 1200)由配备有泵的高效液相色谱泵、进样系统、紫外检测器和色谱柱加热器组成。色谱柱为反相柱(Nucleosil 100-10C18，长250 mm，直径4.0 mm)，柱温为30±2℃。流动相为60% v/v的10 mM KH2PO4和40% v/v的甲醇，以1.5mL/ min的流速泵送，在254 nm波长下检测苯甲醇(tR=4.3 min)、苯甲醛(t= 6.7 min)和苯甲酸(tR= 2.8 min)。稀释液(从各自的研究/稳定性程序中分装到HPLC小瓶中)以10μL的进样量直接进样。该方法表现出优异的精密度/极低的方法可变性，对应的相对标准偏差为0.11%，证明在每个测试条件下使用一个注射器/样品是合理的。

2.4.鱼骨图

系统分析了可能导致BzOH含量下降的不同变量，并设计了Ishikawa图。Ishikawa/鱼骨图的设计有助于图形化地突出特定问题或观察的不同潜在原因。它对于风险分类和促进/减轻或消除风险的行动特别有用。一旦发现任何意外事件/观察，必须实施纠正和预防措施。然而，这只有在确定了根本原因并且Ishikawa图工具是实现这一目标的关键推动者的情况下才是可行的[27]。

2.5材料相容性研究

硅橡胶管(内径/内径9.5 mm，外径/外径16.6 mm，长159 cm，Saint Gobain)和含氟聚合物管(内径4.8 mm，外径6.4 mm，长995 cm，Saint Gobain)用WFI冲洗。然后分别向管中填充9.7 mg/mL的BzOH溶液121 mL和43 mL。管子的开口端用不锈钢塞和石蜡膜封住。在室温下孵育各管，分别于24 h和48 h从每个管中取出5 mL样品。包括稀释剂对照(未经处理)，储存在玻璃瓶中，不与任何管道接触。采用高效液相色谱法测定样品中BzOH含量和降解杂质。

2.6.有机硅结合研究

硅油(聚二甲氧基硅烷，1000cSt，陶氏康宁，美国)分别取0 mg、70 mg和140 mg称重，装入三个玻璃瓶(100 mL)中。每个瓶子中的硅油溶解在二氯甲烷(5 mL)中，蒸干二氯甲烷，在瓶子内壁上形成一层薄薄的硅油(干燥过夜)。将稀释剂溶液(9.7 mg/mL)添加到每个瓶子中，得到含有硅油浓度分别为0 mg/mL(对照)、0.7 mg/mL和1.4 mg/mL的稀释剂。用特氟龙胶带(uith – fluorolymer Gewindedichtband, A/E1型，100 g/m2)缠绕瓶线密封，在40±2℃环境湿度条件下孵育。在Eppendorf管中分别于0、2、4周的时间点，用1mL移液管从瓶中取出等量的1 mL，离心，用HPLC检测水相中BzOH的含量和杂质。在每个条件下的每个测试点进行一次测量。

2.7.表面积计算

使用计算机辅助设计(Solidworks 2014, Dassault systemmes, France)计算了顶盖和塞的橡胶部件的表面积。根据制造商提供的主要包装部件的各自配置，模拟了顶盖和塞的工程设计。用该软件计算的总表面积值用于后续计算。

2.8塞子结合性研究

瓶塞结合研究将准备使用的瓶塞以1个/mL (n = 100)的比例在9.7 mg/mL BzOH溶液中孵育于玻璃瓶(100mL)中。瓶用石蜡膜密封，在40±2℃环境湿度条件下孵育。在0、1、2、4周的时间点，用1ml移液管从瓶中抽取1ml的等分液，用高效液相色谱法检测BzOH含量和杂质。在每个条件下的每个测试点进行一次测量。由于注射器1和注射器2具有相同的塞子，因此本研究的结果适用于两种类型的注射器。

2.9.    帽头结合研究

将luer-lock帽头从注射器1的注射器筒上拧下，帽头的橡胶组件很容易从聚丙烯套管中分离(推过)，而不会影响其完整性或造成任何表面擦伤。顶帽(橡胶成分)按1顶帽/mL (n=50)的比例在9.7 mg/mL BzOH溶液中孵育于玻璃瓶(50 mL)中。用石蜡膜密封，在40±2℃孵育。在0、1、2、4周的时间点，用1ml移液管从瓶中抽取1ml的等分液，用高效液相色谱法检测BzOH含量和杂质。在每个条件下的每个测试点进行一次测量。由于在调查时没有注射器2的尖端帽，因此尖端帽结合研究仅在注射器1上进行。

2.10 采用HS-GC-MS进行水蒸气渗透性评估

含稀释剂的注射器；注射器1 (n=3)和注射器2 (n=3)分别密封于HS-GC-MS顶空小瓶中，每种型号各取一支注射器，分别在5℃、40℃和60℃下受压14天。在第14天结束时，采用顶空分析装有小瓶的注射器是否含有BzOH。未包装的稀释液(裸液)和顶空瓶中的水分别作为阳性对照和阴性对照。顶空-气相色谱-质谱分析在配备安捷伦顶空仪器7697A的安捷伦GC 7890A上进行，该仪器与安捷伦三重四极杆MSD 7000相连。采用30 m Agilent HP-5MS色谱柱，膜厚0.25 μm，内径0.25 mm。顶空样品在顶空进样器烤箱中40℃孵育15 min。GC进样器/顶空进样器加热至230℃，同时将 MS 接口设置为 240 °C。使用的温度梯度为：35 °C 持续 1 分钟，每分钟20℃至240℃，保持1分钟。MS扫描在33-400 m/z范围内进行，扫描速度为 5 次/秒。

2.10.注射器的重量分析

PFS(注射器1，n = 5)手动填充约1ml BzOH溶液（9.7 mg/mL），并以 5 mm 的均匀顶部空间加塞。确保注射器表面没有任何粘附液滴。将含有稀释剂的注射器水平放置于环境湿度为40℃的培养箱中。在第0、1、2、4、6、8和12周取出注射器，将其平衡至室温一小时，然后使用称重分析天平称重(Sartorious GmbH，德国)。称重后，将注射器放回培养箱。由于在调查时没有足够数量的注射器2，因此仅对注射器1进行了重量分析。

3.    结果与讨论

3.1稳定性研究

稳定性研究通常在研发早期阶段进行，用以选择最佳的药品包装材料。在我们的一种冻干液稀释剂PFS的技术开发过程中，我们观察到PFS中BzOH含量的减少，特别是在加速(25±2°C/ 60±5% RH)和应力(40±2°C/75±5% RH)条件下(表1)，两种类型的luer-lock注射器被评估为主要包装选择的一部分。在3个月结束时，在实时、加速和应力条件下(注射器1)，定量下降分别为0.3%、0.8%和3.8%。对于另一个测试的PFS(注射器2)，这种下降也是相应的，分别为0.6%、10.9%和12.7%。加速和应力条件有助于提供更快的产品质量数据，并有助于预测在实时存储(5±3°C)条件下可能遇到的任何不可预见的问题。在实时环境中，产品可能无法体验到压力条件，但它们有助于揭示开发早期的意外观察结果。观察到的BzOH下降幅度在3个月时可能不是很显著，但却可以在产品保质期内损害防腐剂含量和潜在的防腐剂功效(在重构后提供)。此外，注射器1和注射器2在BzOH降低方面的相对差异也很有趣，这些观察结果旨在于提供更详细的科学调查，以更好地了解药品和包材之间的相互作用。对于提到的产品，认为BzOH的减少在被选为主要包装材料的注射器1中是非常普遍的。尽管如此，为使产品中BzOH含量满足所需规格，提供给产品的暂定保质期保守地从60个月减少到48个月。在接下来的讨论中；描述了研究BzOH含量降低的方法、实验数据和相应的观测结果。虽然调查的目的是评估注射器1与所选包装配置相关的因素，但注射器2的数据已与注射器1的数据进行了比较，以支持实验/调查结果的假设和推断。

表1含有苯甲醇（10mg /mL）稀释剂的注射器1和注射器2中的产品稳定性总结

3.2鱼骨分析

作为质量风险管理(QRM)框架的一部分，评估和调查对药品质量构成风险的观察结果非常重要[28]。质量风险管理强调在决定是否需要采取额外措施之前，分析风险发生概率和潜在后果的结构化过程。质量风险管理的一个核心要素是确定观察/事件的根本原因和产生因素。不同的程序取决于观察的性质，在处理事件或观察时可能被证明是有用的。鱼骨图是一种广泛使用的工具，用于评估和识别即将发生的问题的根本原因。如图2所示，基于跨职能输入，系统分析了可能导致BzOH含量下降(在非常窄的范围内)的潜在根本原因。对用于BzOH含量测定的分析方法进行了评估，以确定与样品制备、梯度性质、系统适用性、延续效应和方法能力相关的潜在差异。这被观察到在一个非常低的方法可变性控制范围内。环境因素的影响是根据稳定过程中的温度、压力和湿度的变化来评估的，这些变化都在限制范围内。在对记录进行验证后，排除了由于计算错误和未校准仪器而导致的实验室测量误差。评估了与人为干预相关的原因，如错误的标签、分析师培训和使用错误的主要包装材料，并确认为零。可能的原因归因于材料因素，如注射器筒绑定，假设塞和尖端帽结合是观察结果的原因，因为它不能在任何基础上被排除。考虑了BzOH扩散、聚合/降解等分子现象，由于稀释剂注射器的杂质谱在过程中保持不变(或<LOQ)，因此排除了降解。由于这项评估结果，一些因素被排除为可能的根本原因或产生因素，从而可以确定调查的方向。研究范围缩小，以了解密封容器与产品(稀释剂)相互作用的性质，这种相互作用可能导致BzOH含量降低。这些研究在文章后面有更详细的描述。

图2系统分析了可能影响BzOH含量的潜在变量（PPM -主要包装材料）

3.3材料相容性研究

进行了材料相容性研究，以确定BzOH与硅橡胶和含氟聚合物等材料相互作用的性质。之所以选择这些材料，是因为它们通常用于制药生产中，用于在储罐/容器中转移溶液，包括填充到小瓶/注射器中，并且不仅在生产过程中作为产品的接触材料，而且在一定程度上会作为产品储存的接触材料，而这些接触材料的其中一些组件由硅酮/含氟聚合物制成。为了测定含有BzOH的稀释剂的结合/吸附电位，在硅胶管和含氟聚合物管中填充稀释剂(9.7 mg/mL BzOH)溶液，并在两端夹住。在室温下孵育填充管，在24 h和48 h取样，分析BzOH含量和杂质。苯甲醇(BzOH)含量测定结果表明，硅胶管的BzOH损失严重，孵卵24小时和48小时后，BzOH含量分别减少44%和48%(表2)。这种减少与降解产物无关；苯甲醛和苯甲酸保持不变(或< LOQ)。

尽管单位体积稀释剂的接触表面积增加了10倍，但与硅胶管相比，含氟聚合物管没有出现任何吸附，并且在48 h结束时BzOH的含量几乎保持不变。这些测试结果与先前Saller和Bahal等人关于此类现象的检测报告结果一致[29,30]。Bahal等人广泛研究了防腐剂（如对羟基苯甲酸酯、苯甲醇、苯甲酸、山梨酸和苯扎氯铵）在不同管材下的结合行为；有机硅、聚氯乙烯和含氟聚合物可用于制药生产。除苯扎氯铵外，其余防腐剂在硅胶管和聚氯乙烯管中均表现出与时间和浓度无关的损失，但未发生降解。然而，测试的含氟聚合物基管路没有造成任何防腐剂损失[30-32]。同样，Saller等人已经证明，在水溶液中存在的BzOH、苯酚和间甲酚等防腐剂可以吸附并渗透到各种材质的硅胶(聚合物)管，造成防腐剂的显著损失[29]。这清楚地证明了含氟聚合物的惰性性质，并肯定了硅橡胶对BzOH等防腐剂的重吸附潜力。

表2室温孵育后稀释剂在不同管中的BzOH含量

3.4.有机硅结合研究

硅结合研究是基于从报道和观察到的硅胶管和防腐剂之间的相互作用中得出的类比。这引导我们基于假设稀释溶液中的BzOH可以与注射器内壁上的有机硅结合，导致其含量下降，从而测试了BzOH与注射器内壁上的有机硅之间潜在的相互作用。硅油/聚二甲基硅氧烷通常(在PFS生产过程中)应用/喷涂到玻璃注射器的内壁上，以促进PFS中所含药物溶液在给药过程中柱塞的平滑滑动/润滑[33]。每个注射器的硅胶用量取决于注射器的性质(玻璃/塑料)[34]和硅化过程(潜水/固定式喷嘴[35]、硅胶交联[19]等)。有机硅含量属性可以从PFS制造商处索要，对于测试的注射器1，报告的平均有机硅含量为0.7 mg/注射器。将相应含量的硅油加入稀释液中，评价两种浓度下分配诱导的BzOH损失；目标0.7 mg/mL，最坏情况(2倍目标-1.4 mg/mL)。与对照样品(不含硅油)相比，将稀释剂与0.7 mg/mL和1.4mg/mL的硅油(40℃)孵育4周后，BzOH含量(和杂质)未见减少(图3)。这一观察结果与硅胶管报道结果不同，可以用硅胶管与硅油所提供的硅胶基质性质的差异来解释。硅胶管提供了一种具有一定孔隙率/渗透率的物理基质(聚合物和填料)，从而导致BzOH分子将物理置于其间隙空间中，该空间通过硅胶多聚合物和BzOH之间的化学相互作用加强。此外，有研究表明，苯甲醇不仅可以穿过油管壁，而且还在油管外壁释放到环境中，并形成一个梯度，促使其穿过油管渗透[30,36]。在添加了硅油的稀释剂溶液中缺乏这种基质效应，加上少量硅油所提供的较低的界面面积，可能解释了这一现象。此外，实验结果也可能是由于与BzOH（9.7 mg/ml）相比，硅油的量（最大1.4 mg/ml）要少得多。但是，所测试的硅油量对应于所评估的注射器中存在的最大量，可以确保研究的代表性。因此，导致BzOH含量下降的可能原因就排除了注射器筒上的硅油。

图3加标硅油对40°C（玻璃瓶中）条件下稀释剂中BZOH含量的影响

3.5塞子结合性研究

已知防腐剂会与主要包装的橡胶成分结合。不同的橡胶配方与防腐剂的结合倾向不同[37,38]。因此，塞子被认为是导致BzOH还原的另一个潜在来源，因此，进行了防腐剂结合研究。将塞子(1个塞子/mL稀释剂，对应于每单位体积稀释剂的480 mm2塞子表面积，表面积见表3)与稀释液孵育4周后，BzOH下降了5%(见图4)，而对照样品没有任何变化，稀释液溶液中没有加盖塞子。这转化为塞子每单位面积减少1%的BzOH。

虽然实验装置代表了一个封闭的系统，该系统无法确定橡胶材料的扩散，但它确定了BzOH对橡胶表面的吸附/结合亲和力，这是传输/扩散之前的第一步。将这些实验结果与橡胶配方的相关的相关物理化学属性进行比较，如水分蒸气传输（MVT）和氧气传递（OT）值，这些值是使用制造商提供的方法（见表4），在标准厚度约为0.035 英寸的橡胶片上测定的。研究中使用的橡胶塞配方的水汽透射率(MVT)为0.1 g/(m2*天)，氧气透射率(OT)为63.6 cc/(m2*天)，与研究中使用的其他橡胶成分(见表4中的注射器1)相比，这一数字明显较低。此外，本研究中使用的塞子具有含氟聚合物薄膜，该薄膜存在于塞子(填充注射器)与产品接触部分。本研究含氟聚合物薄膜占产品总暴露塞表面积(480 mm2)的27% (130 mm)(表面积见表3)，对BzOH呈惰性表面。单位暴露表面积BzOH下降相对较低，产品接触表面存在惰性含氟聚合物膜，以及两种不同类型注射器的塞子均为常见类型这一事实，排除了塞子降低BzOH含量或通过其传输的任何蒸汽的潜力[30]。因此，预计橡胶塞/柱塞对PFS中BzOH含量的影响最小。

表3注射器1中橡胶成分的表面积（约数）

3.6针头护帽结合性研究

针头护帽代表与药品接触的另一种橡胶成分。之前曾报道过针式PFS的针状堵塞，原因是水汽穿过针状屏蔽层，从而导致PFS系统/设备的功能不佳[20,21]。在本研究中，将注射器1的PRTC橡胶成分与聚丙烯套管分离，以排除与塑料套管的任何潜在相互作用，仅评估橡胶配方与稀释剂之间的相互作用。与针头护帽孵化的稀释剂(单位橡胶针头护帽/毫升的稀释剂，对应于每单位体积稀释剂有450mm2的针头表面，表面面积见表3)，在40°C条件下，与对照组相比，在4周结束时，BzOH含量下降了约14%，而对照组没有下降（见图5）。这相当于每单位表面积暴露的针头护帽，导致BzOH含量的降低3%，这一结果是观察到的塞子的3倍。这一观察结果与针头护帽橡胶配方(可从相应制造商处获得)的渗透特性相一致，与塞子相比，该配方具有1.5g/ (m2*天)的高水汽透过率(MVT)和1607.4.2 cc/(m2*天)的高氧气透过率(OT)(表4)。以上结果连同来自制造商的渗透数据证实了材料表面结合/吸附和传输/扩散之间的联系，因为化合物必须首先在材料表面上进行扩散。这一现象与Saller等人所展示的情况相似。针头护帽/针罩橡胶配方通常对气体（如乙烯氧化物）具有一定的渗透性，以确保其可以配合注射器筒一起灭菌（化学）[26]。然而，这可能会对药物产生不利影响，例如导致针眼堵塞（含PFS的生物制剂）或防腐剂损失，在开发过程中需要予以适当考虑。对于PFS产品来说，产品针头护帽接触面积仅占总接触面积的一小部分，并且只与主要包装部件接触。但是，橡胶配方的均匀材料特征（与塞子不同）有助于我们将这些观测值推断为注射器中包含产品时的实际情况。以前的研究的报告也证实了这一点，在该研究中，相对较小的针头护帽产品接触表面积会导致足够的水蒸气传播以引起固定的PFS针头堵塞[20,21]。结合测量和结果以及基于饱和动力学，但仍反映了BzOH与橡胶表面吸附/结合亲和力之间关系。该研究在应力条件下（40°C）进行，旨在快速探索BzOH与橡胶之间相互作用。类似于塞子结合研究，因此，它只能解释防腐剂与橡胶成分表面结合的亲和力，而不是防腐剂对穿越整个橡胶配方及其随后与环境的交换。但是，结合代表了在橡胶系统传输/扩散之前的主要和速率确定步骤[29]，因此这些研究对于支持我们的进一步推论非常重要。

表4橡胶制剂的物理化学特性评价

图5在40℃时，针头护帽橡胶组分（单位/mL）对稀释剂BzOH含量的影响（橡胶尖端的表面积：稀释剂= 45000 mm2：50 mL）

3.7.气相色谱-质谱法测定水蒸气渗透性

本研究采用气相色谱-质谱法测定水蒸气渗透性，探究了苯酚与橡胶组分之间的结合行为以及所研究橡胶组分的性能。我们假设针头护帽可能导致苯酚通过吸附-扩散-解吸机制在其基体上损失。为评估注射器中稀释剂与外部环境之间的关系，需要使用一个模拟注射器系统的封闭系统。密封的HS-GC/MS小瓶提供了这种条件，其中将含有稀释剂的注射器系统密封到小瓶中（见图6），并在不同温度（2-8°C、40°C和60°C）下保存14天。选择2-8°C和40°C作为代表性条件（最低值和最高值）进行常规稳定测试。在60°C下进行了额外的评估，该评估是在极端恶劣的情况下，并有助于评估温度的影响。随着温度升高，内部水分和苯酚蒸汽压增加驱使它们通过橡胶组件（特别是针头护帽）进入气相色谱-质谱小瓶顶部空间，在结束时可以检测到它们。从图6中可以看出，在包含注射器系统且被控制在其中的情况下检测到了对应于苯酚信号峰值面积。这表明在给定温度和条件下，苯酚可以横穿主要包装材料。由于在给定浓度下模拟扩散过程的复杂性，生成校准曲线以对从注射器中出现的BzOH进行准确定量，这是非常具有挑战性的。但是，与BzOH信号峰相对应的面积可以用作相对定量和了解注射器系统之间差异的度量。

由于柱塞的塞子与针头护帽相比显示出较低的BzOH结合倾向，并且塞子的产品接触部分由含氟聚合物制成，因此BzoH有望主要从尖端帽中出现。观察到BzoH对含氟聚合物具有惰性并且不与之结合的观察结果得到了证实[29,30]。从注射器2出现的BzoH峰面积比在所有温度条件下观察到的注射器1观察到的面积高许多（图7）。注射器1和注射器2之间BzOH损失的趋势可以很好地与它们的橡胶特性相关（表4），其中注射器2的针头护端具有MVT（1.6次）和OT（2.5倍），而OT（2.5倍）高于注射器1的针头护帽。鉴于两个注射器塞子的特性（MVT和OT）都是相同的，并且产品接触表面均是由含氟聚合物制成的，可以推断出BzOH的损失主要是由于蒸气通过针头护帽渗透/扩散造成的。

图6 注射器1（绿色）和注射器2（红色）在密封顶空瓶中40°C孵育14天后的代表性HS-GC色谱图(x轴：以任意单位计数；y轴：采集时间分钟）

图7在2 - 8°C,、40°C和60°C时，通过HS-GC-MS分析了BzoH通过注射器1（灰色）和注射器2（橙色）的尖端帽14天的潜伏期

3.8. 注射器的重量分析

对注射器1中蒸汽（水/BzoH）的传输进行了评估。在环境湿度条件下，5支装满稀释剂的注射器以水平方式存放于40℃。注射器的平均重量与其称重时间点相对应。在研究过程中，注射器的平均重量呈线性下降趋势（约0.075 mg/周），与研究开始时的平均重量相比，12周结束时的平均重量减少了1 mg。根据应力条件下的稳定方案，在3个月结束时，BzOH损失估计为0.38 mg（见表1）。假设损失的BzOH可能与橡胶组分结合或释放到环境中，则本研究中剩余体重损失可以归因于水蒸气的损失。这种行为类似于Bardi等人报道的固定针式PFS，其中已经证明了水蒸气穿透整个PFS刚性针罩[21]。如图8所示，注射器1的重量损失以及HS-GC-MS分析显示的BzOH蒸气传输与评估PFS的推理非常复杂，该推论推断出允许水以及BzOH蒸气通过其针头护帽。总而言之，我们通过一系列实验（第3.2-3.7节）进行系统地证明，这是BzOH含量降低和过程中可能发生的最可能原因。

结合实验可以突出表面吸附的关键，这是在跨橡胶基质进行传渗透/扩散之前的首要步骤。特别是HS-GC-MS实验证实了BzOH的渗透/扩散（也称为传输）以及释放到环境中确实会发生且与温度有关。结合强度（第3.4节和3.5节）和橡胶组分之间的相对扩散（第3.6节）以及主要包装组分的渗透属性（表4）有很好的相关性，在稳定性程序（第3.1节）的读出过程中也反映了这一点。该调查旨在揭示BzOH在整个PFS中减少的性质和方法。整体观察到的现象可以预期采取以下步骤；“结合/吸附-扩散/传输-解吸”，基于各自章节中描述的结果。

图8 在40℃环境湿度条件下，注射器1 （n = 5）的注射器平均重量

4.    结论

药品初始包装的选择往往是经验性的，且以耗时的稳定性研究为基础。事先了解和评估容器封闭系统的物理化学性质，可以帮助预测和减轻在稳定性研究过程中遇到的不可预见的问题。在这篇文章中，我们提出了一个案例研究，在稳定性期间预灌封注射器中BzOH含量降低。BzOH含量降低会降低防腐剂含量，影响稀释剂对重组产物的防腐效果。我们已经证明，BzOH不仅可以与PFS的橡胶成分结合，而且可以在整个橡胶配方中扩散/渗透，从而导致一段时间内防腐剂含量的减少。此外，所描述的观察结果(对于BzOH)也可以适用于其他防腐剂(如苯酚，甲酚和对羟基苯甲酸酯)，它们具有相似的物理化学性质，并用于肠外制剂。必须尽早识别这些信号，并将其与预期的货架寿命条件相关联。我们在此类研究中首次展示了如何使用HS-GC-MS来更好地理解产品与容器封闭之间的相互作用。在早期开发中部署此类工具，再加上对主要包装的详细了解可以帮助您正确地选择包装。对于含有防腐剂特别是BzOH的PFS的开发，建议选择MVT和OT值较低的橡胶配方用于针头护帽和塞子。此外，可以通过在产品接触面涂覆惰性材料(如含氟聚合物)来防止防腐剂与密闭容器发生相互作用。BzOH含量的降低可能受BzOH浓度以及预期货架期的持续时间的影响，这需要根据具体情况进行评估。我们的观察结果还强调了包装组件的制造商需要开发具有改进性能的材料，以确保产品质量并最终确保患者的安全。