大麻是桑科大麻属一年生直立草木植物，可分离出大麻素，主要成分为大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚，总量占大麻素提取物的40%以上。大麻在临床上有镇痛、抗呕吐、抗肿瘤、抗菌以及抗癫痫和镇静等功效，而且大麻耐受性高，在医疗领域应用广泛。目前，大麻在食品中的应用在很多国家都已合法化，但是被我国法律法规禁止。由于大麻在国外多使用在烘焙食品中，随着进口食品的增加，添加了大麻的食品的输入风险也随之增加。因此，需要开发高效快速的检测食品中大麻的方法，以保障消费者的健康安全。

     大麻酚类化合物的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和气相色谱-质谱法。液相色谱法虽然应用较普及、适用范围广，但是检测器选择性低、检出限高且检测结果容易受杂质影响，需要进行较繁琐的净化前处理，试验过程耗时耗力。质谱法选择性高，对前处理要求低，可实现目标物含量较低的样品的高通量检测。本工作采用分散固相萃取法进行前处理，超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法（UHPLC-Q-TOF/MS）定性定量检测膨化食品中3种大麻酚类化合物，可为相关化合物测定提供一定参考。

1、 试验方法

    取粉碎后的样品置于离心管中，依次加入水、乙腈、无水硫酸镁和氯化钠，涡旋振荡，离心后取上清液置于含有C18和PSA的离心管中，涡旋，然后离心，上清液过滤膜，滤液按照仪器工作条件测定。

2、 结果与讨论

2.1 仪器工作条件的优化

     大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚的结构上均含有苯环和酚羟基，苯环上的大π键电子云密度较大，加强了酚羟基上氧原子的电负性，从而使酚羟基更易失去H+，在ESI−和碱性洗脱条件下，这些目标物更易形成稳定且丰度较高的母离子[M−H]−，且母离子精确m/z的相对误差绝对值均不大于1.0×10−6；调节去簇电压，使3种目标物的母离子丰度达到最佳，并采用母离子定量（峰面积）和定性（精确m/z）。调节碰撞能量，使二级碎片离子尽可能多且丰度较高，选择丰度较高的碎片离子辅助定性，其中互为同分异构体的大麻二酚和四氢大麻酚需要添加保留时间进行定性。优化后的质谱参数见表1。

表1 质谱参数

     大麻二酚和四氢大麻酚互为同分异构体，通过调节梯度洗脱程序，可实现二者的基线分离。混合标准溶液的提取离子色谱图见图1。

2.2 基于单因素法的前处理条件的优化

2.2.1 提取溶剂及其用量

     以加标阴性米饼样品为待测对象，试验考察了分别以甲醇、乙腈和乙酸乙酯为提取溶剂时对3种目标物回收率的影响，结果见图2。

     结果显示：乙酸乙酯对3种目标物的提取率较低，回收率在50.0%~65.0% 内，可能原因为含有酚羟基的大麻酚类化合物具有一定的亲水性，不易被极性较低的乙酸乙酯提取；甲醇的回收率也较低，这是由于甲醇与水之间的氢键作用较强，部分有机相未在加入盐后析出，导致提取液中目标物变少，且杂质增加，基质效应增强；乙腈提取率最高，可能原因是乙腈的极性介于甲醇与乙酸乙酯之间，与3种大麻酚类化合物的极性相似，且与水之间的氢键作用弱于甲醇的，3种目标物可在盐析时随乙腈相析出，杂质提取量减少，基质效应降低。因此，试验选择的提取溶剂为乙腈。

     试验进一步比较了乙腈用量分别为5，10，15mL时上述加标样品中目标物回收率的变化。结果显示：乙腈用量为5mL时，3种目标物的回收率低于60.0%；乙腈用量为10mL和15mL时，3种目标物的回收率均能达到80.0%以上。为了节省溶剂，试验选择的乙腈用量为10mL。

2.2.2 提取方式

     试验对比了超声、涡旋振荡和水平振摇等3种提取方式下2.2.1节加标样品中目标物回收率的变化，结果见图3。

     由图3可知，涡旋振荡提取率最高，水平振摇次之，超声最低，推测在盐析作用下，乙腈相与水相分离，而超声不能使两相充分混合。因此，试验选择的提取方式为涡旋振荡。

2.2.3 净化剂及其用量

     膨化食品中含有大量的淀粉、糖、油脂以及呈味物质，此类杂质在提取过程中会被大量提取到乙腈相并影响目标物的准确测定，因此需要对提取液进行净化。按照试验方法处理2.2.1节加标样品，并分别以C18、PSA、GCB及中性氧化铝净化提取液，3种目标物的回收率见图4。

     由图4可知：以中性氧化铝和GCB净化时，3种目标物的回收率较低，可能原因是中性氧化铝上铝中心会与大麻酚化合物上酚羟基相互作用，导致目标物吸附，GCB对具有平面结构的化合物有较强吸附，导致以这二者净化时目标物回收率降低；以C18和PSA净化时，二者所得目标物的回收率均较高且相当。考虑到C18主要吸附提取液中的油脂等低极性物质，PSA主要吸附糖类或大极性物质，二者除杂类型不同，选择 C18和PSA联合净化，并进一步探究二者用量的比例。由于PSA所得目标物的回收率稍低于C18的，因此在选择净化剂组合用量时，适当降低了PSA的用量，并比较了净化剂组合分别为100mgC18+20mgPSA、100mgC18+30mgPSA、100mg C18+40mgPSA、200mgC18+20mgPSA、200mgC18+30mgPSA、200mgC18+40mgPSA（分别标记为净化剂组合1#~6#）时2.2.1节加标样品中 3种目标物回收率的变化，结果见图5。

     由图5可知：C18用量为200mg时，3种目标物的回收率明显高于100mg时的；PSA用量为20mg时，3种目标物的回收率较低，除杂可能不完全，PSA用量为30，40mg时的回收率均较高，但是PSA用量为30mg 时的稍高。因此，试验选择的C18和PSA用量分别为200mg和30mg。

2.3 基于响应面法的净化剂和提取溶剂用量的优化

     基于单因素试验结果，采用响应面法进一步优化C18、PSA以及乙腈的用量。以各因素为自变量，四氢大麻酚回收率为考察指标，采用Design Expert软件根据中心组合设计原则设计三因素三水平试验，自变量编码及水平见表2。

表2 响应面试验自变量编码及水平

     按照表2设计的响应面试验方案，按照试验方法进行三因素三水平共17组试验，结果见表3。

表3 响应面试验结果

    以四氢大麻酚回收率（Y）为考察指标，对响应面试验结果进行二次回归拟合，得到拟合方程（模型）为Y=93.44+1.025A-0.3999B+5.250C+0.4750AB-1.425AC-0.9250BC-6.033A2-5.282B2-8.3325C2，相关系数为0.9949，说明该模型可以进行较准确的预测。采用方差分析法（ANOVA）对模型及各因素进行显著性检验，结果见表4。

表4 响应面模型的方差分析结果

     由表4可知，A、C、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，说明这5个因素对四氢大麻酚回收率影响显著；F值与各因素影响程度呈正相关，比较各因素的F值，可知对四氢大麻酚回收率影响程度由大到小的因素依次为C、A、B。考虑到交互因素AC对四氢大麻酚回收率影响更显著，进一步绘制其响应面和等高线图，结果见图6。

    基于所建模型，采用Design Expert 软件预测净化剂和提取溶剂的最佳用量，结果为C18用量196.3mg，PSA用量26.2mg，乙腈用量11.1mL，该组合条件下四氢大麻酚的理论回收率为93.6%。简化试验，将各试剂用量定为 C18用量200mg，PSA用量30mg，乙腈用量10mL，按照1.3节方法在此条件下进行6次平行试验，以验证模型的预测准确度。结果显示，四氢大麻酚的回收率为94.1%，与预测值基本一致，说明模型预测较准确。

2.4 基质效应

     考虑到净化后膨化食品里的淀粉、糖类、油脂等物质还会被提取至有机相，影响测定结果的准确度，试验对基质效应进行了探讨。分别采用空白米饼、饼干、薯片基质溶液和乙腈配制标准溶液系列并绘制标准曲线，以二者标准曲线斜率的比值（K）评价基质效应。若K值为90.0%~110% 时，基质效应不明显，可忽略；若 K值小于90.0% 或大于110%时，分别存在强基质抑制效应或强基质增强效应，基质效应不能忽略。结果显示，在米饼、饼干和薯片3种基质中，K值分别为76.5％~83.2%、79.9％~ 87.7%和 82.8％~90.9%，基质抑制效应明显。为消除基质干扰，试验采用基质匹配法定量。

2.5 工作曲线、检出限和测定下限

     以基质效应相对较严重的空白米饼基质溶液配制基质匹配混合标准溶液系列，按照仪器工作条件测定，以3种目标物的质量浓度为横坐标，对应的母离子峰面积为纵坐标进行线性回归。结果显示，3种目标物的质量浓度均在5.0~200μg·L−1内和母离子峰面积呈线性关系，其他线性参数见表5。

表5 线性参数

    以3，10倍信噪比（S/N）计算检出限（3S/N）和测定下限（10S/N），结果分别为10.0，25.0μg·kg−1。

2.6 精密度和回收试验

     参考文献按照试验方法对阴性米饼进行3个浓度水平的加标回收试验，加标量分别为 1，2，10倍测定下限，每个加标水平平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差（RSD），结果见表6。

表6 精密度和回收试验结果(n=6)

    由表6可知，3种目标物的回收率为 81.9%~ 94.1%，测定值的RSD为3.9%~7.3%，方法的准确度及精密度可满足膨化食品中3种大麻酚类化合物的日常测定要求。

2.7 样品分析

     随机选择国内及国外的3种基质样品各15个（米饼、饼 干、薯片各5个），按照试验方法测定。结果显示，在1个进口饼干样品中检出了大麻酚（27.8μg·kg−1）、大麻二酚（113μg·kg−1）和四氢大麻酚（30.6μg·kg−1），其他样品均未检出这3种大麻酚类化合物。

3、 试验结论

     本工作采用乙腈提取膨化食品中的大麻酚、大麻二酚和四氢大麻酚，PSA和C18联合净化提取液，并采用单因素和响应面法优化了提取溶剂和净化剂的用量；净化液采用UHPLC-Q-TOF/MS检测，3种大麻酚类化合物在8min内出峰，互为同分异构体的大麻二酚和四氢大麻酚实现了基线分离，且母离子理论精确m/z与实测值相对误差较小，可用于3种大麻酚类化合物的准确定性；以基质匹配法定量，可消除基质抑制效应的干扰，且方法检出限、准确度和精密度均较好。以上结果说明本方法可应用于膨化食品的批量分析。

作者：郝志明1，冯奎2，肖艳萍1，李冬梅1，李宝玉1，姚小华1，赵培静3，吴燕燕4

单位：1. 广东农工商职业技术学院；

2. 佛山象尚食品科技有限公司；

3. 广东省华微检测股份有限公司；

4. 中国水产科学研究院南海水产研究所 农业农村部水产品加工重点实验室

来源：《理化检验-化学分册》2024年第10期