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嘉峪检测网 2024-12-25 08:28
摘 要: 基于高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)获得的色谱-光谱数据,建立了一种二元完全重叠液相色谱峰的快速解析定量方法:将HPLC-DAD采集的时间t、波长λ、吸光度S的三维光谱色谱数据,光谱经过背景补偿加Savitzky-Golay平滑预处理,得到光谱波长方向的吸光度强度处理值随时间变化的光谱图,与对照品光谱计算光谱相似度,实现重叠峰的快速智能化识别;利用导数光谱色谱图法对预处理的色谱-光谱矩阵进行解析,获得原点波长,再利用二维相关光谱技术提取特征光谱后,得到基于特征光谱的原点波长的色谱流出曲线,进而得到分离后的色谱峰,实现重叠色谱峰的定量测定。该方法充分利用HPLC-DAD获得的三维色谱-光谱数据信息,能够将二元完全重叠色谱峰有效解析分离和定量测定,明显提高解析结果的准确度,并利用色谱工作站实现了数据采集、解析识别、定量分析一体化智能分析,方法简单高效。
关键词: 二维相关谱技术; 导数光谱色谱图法; 高效液相色谱-二极管阵列检测器; 化妆品; 重叠峰; 识别; 解混
高效液相色谱法-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)联用技术作为复杂组分分离和定量分析的手段之一,具有分析速度快、分离效率高、样品用量少等优势[1],通过成功的色谱分离,实现混合物中各物质的定性和定量分析[2]。多数色谱工作站采集的是时间、波长、吸光度强度三维数据而获得三维色谱-光谱图,但是随着样本复杂程度的提高,往往会有重叠峰的出现,事实上,实际色谱图中绝大多数色谱峰都为重叠峰,重叠峰的紫外吸收光谱不利于对结构确证和色谱峰的识别,而色谱峰用于定量计算主要是获得每个单峰的面积,因此重叠峰的分离是方法开发的一个难题[3]。重叠峰的分离多采用优化色谱条件的方法,但方法优化费时费力,对于多组分复杂基质的分离效果也不尽如人意;随着化学计量学的发展,将三维色谱光谱信息,按一定的数学模型处理,能解决重叠峰的识别和定量难题,目前常用的重叠峰解析方法包括模式识别[4]、曲线拟合[2,5-6]、小波转化法[7‒8]、因子分析[9]、正交投影[10]等方法,然而上述方法多为光谱解析方法,即在一维水平上进行解析,存在解析结果准确性和可靠性不高的问题,解析结果易受色谱峰重叠度的影响;且利用色谱工作站数据分析系统的化学计量学解析分离算法报道较少。
二维相关谱技术(2D-COS)[11]是将传统光谱信号扩展到三维平面上,光谱图具有两个独立的变量和一个表示体系光谱学性质的因变量,从而形成三维立体数据,通过研究体系光谱学性质随两个变量(特定外扰)变化的情况以及两个变量的相关性,可提供研究体系中不同组分官能团吸收峰之间的相关信息,可有效地对弱峰、覆盖峰、偏移峰进行解析,具有较高的光谱分辨率;而且可以通过同步和异步谱交叉峰正负或有无明确各分子官能团振动变化先后顺序,可以分析信息来源,提高光谱的解释能力,实现对化合物结构的解析;二维相关谱技术表征的是随特定外扰变化的信息,消除了强背景信号对待测组分弱信号的干扰,有助于提取复杂体系中随外扰变化微弱的特征信息。加上外扰选择方式的多样性,如温度、时间、浓度、激发波长、偏振角、pH等;探针的多样性,包括红外光谱、拉曼光谱、荧光光谱、NMR、X射线等,因此,相对于传统一维光谱,二维相关谱技术具有高选择性、高分辨率、高图谱解析能力,是一种强大灵活的光谱技术。正是由于二维相关谱的上述优势,自广义二维相关谱理论提出以后,该技术就被广泛应用于物理、化学[12]、材料[13]、食品[14]、环境[15]等领域。
导数光谱色谱图法(i-PDeA)是对由二极管阵列检测器(DAD)得到的数据,将光谱波长方向的导数值随时间变化转化为色谱图的方法。它的基本原理是通过对色谱-光谱数据进行数学导数运算,从而增强和突出样品中的特定信息,由于导数光谱值遵从朗伯-比耳定律,且具有加和性,以便更容易识别和定量分析化合物。i-PDeA具有峰增强、噪声减小、无需基线校正、提供结构特征等优势,特别适用于复杂或重叠的光谱解析。它在化学、生物化学、环境科学等领域中都有广泛的应用[16]。
依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)7.2节对苯二胺等32种组分的检测方法,使用HPLC-DAD同时分析染发剂中的32种染料成分时,共有3个色谱系统,第1个色谱系统分离包括对氨基苯酚等16个组分,第2个色谱系统分离包括2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐等10个组分,第3个色谱系统分离其余8个组分。当待测样品中同时含有对氨基苯酚和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐时,在第2个色谱系统下,对氨基苯酚的色谱峰会对2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐的色谱峰产生干扰,形成完全重叠峰,无法准确测定2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐的含量,如果通过调节色谱条件实现干扰色谱峰的完全分离,分离过程不仅费时费力,且会影响组内其他10个色谱峰的分离,达不到预期效果。
笔者以化妆品中染发剂对苯二胺和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐为例,采用二维相关谱技术,以浓度为外扰,构建其分析体系的同步和异步二维相关光谱,根据同步谱中交叉峰的正负和异步谱中交叉峰的有无提取特征光谱波长,并对色谱-光谱数据进行数学一阶导数运算,分别提取特征原点波长λx和λy通道的导数光谱色谱图,得到将混合组分分离后的导数光谱色谱图,实现在色谱分析软件上自动化的色谱解析分离以及两种完全重叠组分的定性和定量分析,实现数据采集、预处理、光谱色谱解析一体化自动分析。该研究不仅为化妆品中安全风险物质HPLC-DAD色谱-光谱库的建立提供试验基础,也为复杂体系中多组分的重叠峰同时分析提供一种可行性方法,并实现了利用色谱分析软件进行数据采集、解析识别、定量分析一体化智能分析,简化了数据处理方法,提高了检测效率。
1、 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
高效液相色谱仪:30A型,包括SPD-30A二极管阵列检测器(DAD)和LCsolution色谱工作站,日本岛津公司。
超声波清洗器:Wiggens UA22MFD型,德国瓦里根公司。
高速离心机:Thermo ST16型,美国赛默飞世尔科技公司。
数据统计分析软件:Origin2021软件、SPSS数据统计软件。
甲醇、乙腈:均为色谱纯,美国赛默飞世尔科技公司。
超纯水仪:Milli-Q型,美国密理博公司。
对氨基苯酚对照品:质量分数为98.59%,批号为G979983,德国Dr Ehrenstorfer公司。
2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐对照品:质量分数为99.9%,批号为FS1618266,天津阿尔塔公司。
11批次染发剂样品:来自2022年国家化妆品监督抽检的染发剂样品。
实验用水由超纯水仪制备。
1.2 仪器工作条件
色谱柱:SUPELCO Discovery RP-AMIDE C16保护柱(50 mm×4.6 mm,5 μm,美国色谱科公司)和Discovery RP-AMIDE C16分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美国色谱科公司);流动相:A相为磷酸盐混合溶液[称取十二水合磷酸氢二钠1.8 g、磷酸二氢钾2.8 g和庚烷磺酸钠(C7H15SO3Na)1.0 g,用水稀释至1 L,混匀,制成含庚烷磺酸钠(1 g/L)的磷酸盐缓冲液,用磷酸溶液(10%)调节pH至6.0],B相为甲醇;洗脱方式:等度洗脱,A相∶B相=90∶10(体积比);流量:1.0 mL/min;检测波长:190~400 nm;柱温:25 ℃,进样体积:5 μL。
1.3 实验步骤
1.3.1 样品预处理
称取样品0.5 g (精确到0.001 g)于10 mL具塞比色管中,加入50 %乙醇水溶液至10 mL标线,涡旋1 min,冰浴超声提取15 min,在0 ℃下以10 000 r/min离心5 min,取上清液经0.45 µm微孔滤膜过滤,滤液作为样品溶液,并尽快测定。
1.3.2 标准工作溶液的配制
精密称取对氨基苯酚和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐对照品约50 mg,置于10 mL容量瓶中,用无水乙醇稀释至标线,配制成质量浓度为500 mg/L的混合标准溶液;取混合标准溶液适量,用无水乙醇稀释,配制成质量浓度分别为5、10、25、50、100、250、500 mg/L的混合标准工作溶液。临用现配。
1.3.3 数据的获得
在1.2节仪器工作条件下分别测定对氨基苯酚(以下简称成分x)和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐(以下简称成分y)的标准工作溶液和样品溶液,分别获得对氨基苯酚和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐对照品溶液的三维谱图数据以及二者混合对照溶液的完全重叠峰的谱图数据,图1为成分x和成分y混合对照品溶液、成分x和成分y对照品的三维色谱-光谱图。
图1 三维色谱-光谱图
Fig. 1 Three-dimensional graphs of the peaks
2、 结果与讨论
2.1 数据预处理
光谱分析中常用预处理方法一般为背景补偿、Savitzky-Golay卷积平滑、一阶/二阶导数校正(1stDer/2stDer)、标准正态变换(SNV)、最大最小归一化、光谱数据中心化等。背景补偿和S-G卷积平滑可以减小仪器噪声对光谱的影响,提高信噪比,而不改变光谱形状和宽度;导数校正可以消除基线漂移、提高光谱分辨率[16]。
利用LCsolution色谱工作站处理数据,选择成分x和成分y对照品溶液采集的吸收光谱,或者选择成分x和成分y混合对照品溶液采集的重叠色谱峰中仅存在成分x和y的保留时间处,将色谱峰斜率上升时的光谱视为成分x的吸收光谱,斜率下降时的光谱视为y的吸收光谱,对其吸收光谱进行背景补偿加Savitzky-Golay平滑预处理,去除噪音和背景干扰、降低基线漂移的影响,但是不改变光谱形状和宽度。将预处理后的标准化光谱与对照品的标准化光谱库(自建数据库)比较,进行库搜索,计算相似度,进行色谱峰识别。
图2为成分x和成分y的对照品的标准化光谱图以及其解析分离后的标准化光谱图,由解析分离后的标准化光谱图与对照品的标准化光谱计算相似度,成分x相似度为0.998 220,成分y的相似度为0.998 267,均大于相似度阈值0.99。实验结果表明重叠峰经过解析分离后,可以实现色谱峰的快速智能化识别。
图2 光谱图
Fig. 2 Spectrum of the peaks
2.2 特征波长的提取
将不同浓度待测物系列对照品溶液,按照1.3.1采集其随浓度变化的二维动HPLC-DAD色谱-光谱数据。根据Noda理论[17]及选择浓度为外扰,并将采集的混合染发剂体系随外扰变化的一维动态光谱矩阵A(m×n),基于式(1)和式(2)进行相关计算,分别得到混合染发剂体系随外扰变化的同步和异步二维相关谱矩阵Φ(ν1,ν2)和Ψ(ν1,ν2):
(1)
(2)
式中:m——动态光谱数;
n——光谱变量数;
T——表示转置;
N——Hilbert-Noda矩阵。
(3)
式中:Njk——Hilbert-Noda矩阵第j行和第k列的值。
根据同步谱中交叉峰的正负和异步谱中交叉峰的有无提取特征光谱波长,见图3。同步图3(a)中包括自相关峰和交叉峰,对角线上的峰为自相关峰,对角线外的为交叉峰。对于对氨基苯酚同步二维相关谱,在主对角线197、230 nm处存在自相关峰,表明此波长处的紫外吸收峰强度随外扰的变化而变化,在主对角线外侧(197,230)、(197,295) nm处存在正交叉峰,表明3个紫外吸收峰强度随外扰变化方向相同,其可能来自同一组分。对于2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐同步二维相关谱[见图4(a)],在主对角线207 nm处存在自相关峰,表明此波长处的紫外吸收峰强度随外扰的变化而变化。在主对角线外侧(206,299) nm处存在正交叉峰,表明3个紫外吸收峰强度随外扰变化方向相同,其可能来自同一组分,且为其特征吸收峰。同步和异步二维相关谱计算结果表明197、230、295和206、299 nm处紫外吸收峰分别为对氨基苯酚和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐的特征波长。
图3 对氨基苯酚二维相关光谱
Fig. 3 Two dimensional correlation spectrum of p-aminophenol
图4 2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐相关光谱
Fig. 4 Two dimensional correlation spectrum of 2,4-diaminophenoxyethanolamine hydrochloride
2.3 原点波长的确定
导数光谱色谱图法(i-PDeA)[16]是将某波长光谱的导数值随时间变化转化为色谱图的方法,DAD将通过检测池的透射光经全息光栅色散后形成多色光,同时检测多波长下的吸收可得到采集时间内的色谱-光谱三维图,如果将时间t、波长λ的三维色谱光谱设为S(t,λ),则波长λd的导数光谱-色谱表示为:
(4)
图5(a)是两种成分(目标成分x和y)的吸收光谱,图5(b)是对吸收光谱沿波长方向求导后的导数光谱。将图5中成分x的导数光谱内导数为0的波长设为λx,成分y的导数光谱内导数为0的波长设为λy。波长λx的导数光谱色谱图显示仅含成分y的洗脱曲线、波长λy的导数光谱色谱图显示仅含成分x的洗脱曲线,也就是说可利用波长λx的导数光谱色谱图仅分离y成分,同时可利用波长λy的导数光谱色谱图仅分离x成分。因为为负值,导致导数光谱色谱图的峰值为负,所以需进行正负反转。
图5 成分x和y的光谱和导数光谱
Fig.5 Spectra and derivative spectra of components x and y
将采集时间内的时间t,波长λ的三维色谱光谱设为S(t,λ)三维数据,经过2.1的光谱预处理,对吸收光谱沿波长方向求导后得到导数光谱,以成分x导数光谱值为0的波长创建原点波长,所以波长λx的导数光谱色谱图显示仅含成分y的洗脱曲线、波长λy的导数光谱色谱图显示仅含成分x的洗脱曲线,也就是说可利用波长λx的导数光谱色谱图仅分离y成分,同时可利用波长λy的导数光谱色谱图仅分离x成分。因为在波长λy处成分x的导数光谱为负值,导致导数光谱色谱图的峰值为负,所以需进行正负反转。可获得已去除该成分的色谱图,同法创建成分y的原点波长,求取各导数光谱的原点波长,一阶导数的原点检测结果见表1。当存在多个原点波长时,选择成分x和成分y的特征波长,且另一成分的强度绝对值大的波长,将成分x的导数光谱值的特征波长且是原点波长设为λx,成分y的导数光谱值的特征波长且是原点波长设为λy,实验结果表明,成分x的原点波长为λx=196.59 nm,成分y的原点波长为λy=206.17 nm。
表1 一阶导数的原点检测结果
Tab. 1 Results of origin detection of first-order derivatives
2.4 流出曲线的拟合
求取成分x的导数光谱在波长λx=196.59 nm的吸收强度值±Py和成分y的导数光谱在波长λy=206.17 nm的吸收强度值±Px,分别提取特征原点波长λx和λy通道的导数色谱图,得到将x和y分离后的导数色谱图(见图6),利用导数色谱图,可以得到各成分分离后的色谱图,系列混合对照品溶液的色谱数据同法处理,利用峰面积绘制标准曲线进行定量分析。
a—样品中成分x和y的重叠色谱峰;b—经过解析分离后成分x的色谱峰;c—经过解析分离后成分y的色谱峰图6 实际样品重叠色谱峰解析
Fig. 6 Analysis of overlapping chromatographic peaks in actual samples
2.5 线性关系、检出限与定量限
应用该方法对染发剂中常见的对氨基苯酚和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐的重叠峰进行解析,然后计算解析得到的光谱和对照品的相似度,均大于相似度阈值0.99,说明由分离重叠峰得到的光谱与对照品的光谱无明显差异。在1.2色谱条件下,对对氨基苯酚和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐的重叠峰进行解析分离,分别提取色谱流出曲线,利用色谱峰峰面积(I)和对应质量浓度(ρ)进行一元线性回归,计算得到成分x和成分y的线性方程、相关系数,测定11批样品成分x和成分y的含量,以提取色谱峰信噪比为3对应的样品中的质量分数作为方法检出限,信噪比为10对应的样品中质量分数作为方法定量限。成分x和成分y的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限结果见表2。由表2可知,成分x和y的线性相关系数分别为0.997、0.999 9,方法检出限分别为0.026、0.032 μg/kg,定量限分别为0.08、0.1 μg/kg。
表2 成分x和y的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限
Tab. 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients,detection limits and quantitation limits for components x and y
2.6 对比试验
通过优化色谱条件分离两种混合物,利用色谱峰峰面积和对应质量浓度进行一元线性回归测定其含量,比较解析分离和色谱分离两种方法计算两种成分的含量,结果见表3,并对结果进行Wilcoxon符号秩检验统计,统计结果见表4。由表4可知,检验统计量Z=-0.616,对应的概率值P=0.538,显著性水平α为0.05,由于P=0.538>0.05,因此接受零假设,认为两种方法的测定结果无显著性差异,即经过解析分离后与色谱分离后的测定结果无显著性差异。从光谱的相似性和含量测定的比较结果可知,对氨基苯酚和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐的重叠峰得到了有效分离解析和定量测定。
表3 11批实际样品解析结果
Tab. 3 Analysis results of 11 batch actual samples
注:<0.01%是能检出但低于定量限;DE是检出;ND是未检出
表4 Wilcoxon符号秩检验
Tab. 4 Wilcoxon test statistics
注:1)——基于负号的秩和统计量
3、 结语
探讨了基于HPLC-DAD的完全重叠峰的分离解析方法。在对峰的整体纯度进行评价以后,寻找光谱稳定区域,对得到的三维谱图进行背景补偿和Savitzky-Golay平滑处理;利用二维相关光谱技术(2D-COS)提取特征光谱,利用导数光谱色谱图法(i-PDeA)提取特征原点波长,提取被测组分在特征光谱原点波长处的色谱图,对色谱峰积分实现对完全重叠色谱峰的分离解析并定量测定。将该法用于测定染发剂中的对苯二胺和2,4-二氨基苯氧基乙醇胺盐酸盐完全重叠峰的解析定量分析,将解析结果和对照品的预处理光谱进行比较,光谱图相似度大于0.99,实现色谱峰自动识别;利用解析分离后的色谱峰测定其含量,与色谱分离后测定结果进行比较无显著性差异,得了满意的结果。结果表明,所建立的方法能够有效分离HPLC-DAD采集的光谱具有明显差异的完全重叠色谱峰,实现对复杂体系多组分完全重叠色谱峰的识别和定量测定,并实现了利用色谱工作站进行数据采集、解析识别、定量分析一体化智能分析,简化了数据处理方法,提高了检测效率和准确性,该研究不仅为化妆品中安全风险物质HPLC-DAD色谱-光谱库的建立提供试验基础,并对多组分复杂基质的红外光谱、拉曼光谱、紫外-可见光谱等光谱解析提供思路。
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来源:化学分析计量