摘 要： 采用高效液相色谱法测定化妆品中补骨脂酚的含量，建立不确定度测量的数学模型，评定补骨脂酚含量的不确定度。通过对测量检测过程中不确定度的来源进行分析，量化各个测量不确定度分量，合成了相对标准不确定度和扩展不确定度。结果表明，当化妆品中补骨脂酚的质量分数为558.4 μg/g时，扩展不确定度为18.76 μg/g （k=2，P=95%）。测量不确定度的主要来源为标准溶液配制、样品溶液的配制和标准曲线拟合。在实验过程中可通过选用更为精准的量具，增加平行试验的次数来提高测量结果的准确性。

关键词： 化妆品； 补骨脂酚； 高效液相色谱法； 不确定度

 

补骨脂酚是补骨脂挥发油的主要成分之一[1‒4]，由于其结构与视黄醇类化合物相似，具有促进胶原蛋白合成、抑制炎症反应、激素样作用等功效[5‒8]，已被欧美化妆品企业作为化妆品原料广泛使用。2022年9月，补骨脂酚通过了我国化妆品新原料备案审查，作为处于监测期的原料应用于国内化妆品[9]。目前国内尚无化妆品中补骨脂酚的标准检测方法，为了对相关产品质量安全进行有效的监测，笔者通过研究优化实验条件，建立了适用于化妆品中补骨脂酚质量分数测定的高效液相色谱方法。测量不确定度的评定作为理化检验的重要技术指标，对于检测结果的准确性控制具有重要意义[9‒15]。为了补充化妆品中补骨脂酚测量不确定度相关数据，参考JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》和《化学分析中不确定度的评估指南》，对补骨脂酚测定过程的不确定度来源进行评估，建立不确定度评定模型，为科学评定测量结果和方法提供依据和技术支撑。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：LC 2040C型，带有二极管阵列检测器，日本岛津公司。

电子天平：(1) AL204型，感量为0.1 mg；(2) XP205型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

补骨脂酚标准物质：质量分数为99.2%，批号为FS1648529，天津阿尔塔科技有限公司。

甲醇：色谱纯，北京迪马欧泰科技发展中心。

磷酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器工作条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG Ⅲ色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本大阪曹逹株式会社)；柱温：40 ℃；流动相：A组分为0.1%磷酸溶液，B组分为甲醇，流量为1.0 mL/min；进样体积：10 μL；洗脱方式：梯度洗脱，程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution procedure

 

1.3 实验步骤

1.3.1 系列标准工作溶液配制

补骨脂酚标准储备液：称取补骨脂酚标准物质10 mg (精确至0.01 mg)置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇后涡旋震荡溶解，用甲醇定容至标线，摇匀，配制成质量浓度为1 000 µg/mL的标准储备液。

补骨脂酚系列标准工作溶液：移取标准储备液0.8 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释后定容至标线。随后将该溶液逐级稀释，得到质量浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40、80 µg/mL的系列标准工作溶液。

1.3.2 样品溶液配制

称取样品0.5 g (精确至0.1 mg)于10 mL具塞比色管中，加入甲醇8 mL，涡旋混合30 s后超声提取20 min，冷却至室温，用甲醇定容至标线，混匀。将提取液转移至15 mL离心管中以10 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm有机滤膜后上机测定。

 

2、 数学模型

 

样品中补骨脂酚质量分数的计算公式见式(1)：

 

w=(1)

式中：w——化妆品中补骨脂酚的质量分数，µg/g；

ρ——样品溶液中测得的补骨脂酚的质量浓度，µg/mL；

V——样品溶液的体积，mL；

m——样品称取质量，g。

 

3、 不确定度来源分析

 

由数学模型分析化妆品中补骨脂酚测量不确定度的主要来源有：(1)样品称量引入的不确定度；(2)样品溶液定容引入的不确定度；(3)标准物质引入的不确定度，包括：标准物质纯度、称量和系列标准溶液配制过程引入的不确定度；(4)标准曲线拟合引入的不确定度；(5)样品测量重复性引入的不确定度；(6)液相色谱仪测量引入的不确定度。

 

4、 不确定度评定

 

4.1 样品称量引入的相对标准不确定度urel(m)

样品称量采用感量为0.1 mg的电子天平称量，称量样品质量约为0.5 g。根据天平检定证书，其最大允许误差为0.2 mg，按照矩形分布k=进行计算，由天平单次称量引入的标准不确定度：

u(m)=0.1/=0.057 7 mg

称取样品2份，质量分别为0.502 4 g和0.501 6 g，平均质量为m=0.502 0 g，则样品称量引入的相对标准不确定度：

4.2 样品溶液配制引入的相对标准不确定度urel(V)

样品溶液配制过程用到的量具主要为比色管，其不确定度主要来源于容量允许误差和环境温度。根据JJG 10—2005《专用玻璃量器》规定，10 mL比色管容量允差为±0.10 mL，按矩形分布k=，量具允差引入的相对标准不确定度urel(V1)按照式(2)计算：

 

urel(V1)=(2)

式中：aV——量具校准引起的体积偏差(最大允许误差)。

量具校准温度为20 ℃，甲醇体积膨胀系数为1.2×10-3/℃(20 ℃)，试验温度为21 ℃，温度波动为矩形分布k=，由环境温度引起的相对标准不确定度urel(V2)按照式(3)计算：

 

(3)

式中：aT——温度波动引起的体积偏差，等于温度波动×体积膨胀系数×使用体积。

量具的相对不确定度分量计算结果见表2，样品定容过程引入的相对标准不确定度：

 

表2   量具的相对标准不确定度

Tab. 2   Relative standard uncertainty of measuring tools

 

4.3 标准物质引入的相对标准不确定度urel(S)

4.3.1 标准物质纯度引入的相对标准不确定度urel(w)

从标准物质证书上查得补骨脂酚标准物质的纯度(质量分数)为w=99.2%，扩展不确定度US =0.5%，按照矩形分布k=计算，其纯度引入的不确定度：

4.3.2 标准物质称量引入的相对标准不确定度urel(ms)

标准物质称量使用的电子天平感量为0.01 mg。根据天平检定证书可知，天平最大允许误差为0.02 mg，按照矩形分布k=进行计算，该天平单次称量引入的标准不确定度：

u(ms)=0.02/k=0.011 5 mg

补骨脂酚标准物质称量质量为ms=10.21 mg，则标准物质称量引入的相对标准不确定度：

4.3.3 系列标准工作溶液配制引入的相对标准不确定度urel(ρ)

系列标准工作溶液配制过程使用计量检定合格的容量瓶和移液器，其不确定度主要来源于容量允许误差和环境温度，量具使用的次数见表2。根据JJG 196—2006《常用玻璃量器》检定规程，20 ℃时10 mL A级容量瓶容量允差为±0.02 mL，10 mL比色管容量允差为±0.10 mL。根据JJG 646—2006《移液器》检定规程，1 mL移液器在检定点为1.0 mL时对应容量允许误差为±1.0%，即±0.01 mL；5 mL移液器在检定点为5 mL时对应容量允许误差为±0.6%，即±0.03 mL。

使用量具引入的相对标准不确定度包括：储备液定容的相对不确定度urel(ρ1)、逐级稀释配制溶液时容量瓶使用的相对不确定度urel(ρ2)、1 mL移液器使用的相对不确定度urel(ρ3)和5 mL移液器使用的相对不确定度urel(ρ4)。按矩形分布k=，计算引入的相对标准不确定度见表2。根据各分量合成标准曲线配制过程引入的相对标准不确定度：

合成上述各不确定度分量，得标准溶液配制引入的相对标准不确定度：

4.4 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(L)

补骨脂酚系列标准溶液有7个不同质量浓度，每个质量浓度测定2次，以色谱峰面积和质量浓度进行最小二乘法拟合，得到线性方程和相关系数。回归方程为y=13 834ρ-1 657.3，相关系数为0.999 9，计算结果见表3。样品检验结果均为独立6次测量的均值，由标准曲线校准计算得到化妆品中补骨脂酚质量浓度为ρ0=27.97 μg/mL。实验采用最小二乘法对色谱峰面积A-质量浓度ρ进行线性拟合，残差标准偏差S按照贝塞尔公式(4)计算，由标准曲线拟合引入的标准不确定度uρ按式(5)计算：

 

(4)

 

(5)

式中：a——标准曲线斜率；

b——标准曲线截距；

p——样品平行测定次数；

n——标准曲线各校准点测量总次数；

ρ0——样品溶液补骨脂酚的质量浓度，μg/mL；

ρi——标准曲线各点质量浓度，μg/mL；

——标准曲线各点质量浓度的平均值，μg/mL；

yi——第i次标准溶液色谱峰面积响应值。

表3   标准曲线拟合结果计算

Tab. 3   Results of standard curve fitting

根据贝塞尔公式计算实验的标准曲线拟合引入的标准不确定度为uρ=0.186 6 μg/mL，则由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度：

urel(L)=uρ/ρ0=0.006 67

4.5 测量重复性引入的相对标准不确定度urel(ω)

对样品溶液平行6次测定，进行重复性试验评价，测定值分别为28.01、27.84、28.15、28.31、28.04、27.48 μg/mL，平均值为27.97 μg/mL。利用贝塞尔公式计算求得实验标准偏差后，计算方法测量重复性引入的标准不确定度。

单次测量的标准偏差按式(6)计算：

(6)

式中：j——样品测量次数，j=6；

ρi——每次测得的补骨脂酚质量浓度，μg/mL；

——6次测量补骨脂酚质量浓度的平均值，μg/mL。

将样品测定结果代入式(6)计算可得S(ρ)=0.287 μg/mL。样品平行测量6次，则测量重复性的标准不确定度：

则由测量重复性引入的相对标准不确定度：

4.6 高效液相色谱仪引入的相对标准不确定度urel(I)

由校准证书上可知，实验用LC 2040C高效液相色谱仪定量测量重复性相对标准偏差（RSD）为0.20%，则相对扩展不确定度为0.20%，按矩形分布k=计算，则高效液相色谱仪引入的相对标准不确定度：

urel(I)=0.20%/k=0.001 15

4.7 合成相对标准不确定度urel

相对标准不确定度各分量的分析结果见表4。

表4   各分量的相对标准不确定度

Tab. 4   Relative standard uncertainty of each component

 

 

 

由各分量合成相对标准不确定度：

4.8 扩展不确定度

样品中补骨脂酚测量得到的质量分数w=558.4 μg/g。取置信概率为95%，包含因子k=2[16‒17]，则扩展不确定度：

U=wurel×k=18.76 μg/g

用液相色谱法测定化妆品中补骨脂酚含量(质量分数)，检测结果表示为(558.4±18.76) μg/g，k=2。

 

5、 结语

 

由不确定度分量计算结果可知，高效液相色谱法测定化妆品中补骨脂酚含量的测量不确定度主要来源于系列标准工作溶液的配制，样品溶液定容和标准曲线的拟合。在实验过程中可通过选用更为精准的量具，增加平行试验的次数来降低不确定度，以进一步提高测量结果的准确度。

 

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引用本文： 李莉，王继双，王海燕 . 高效液相色谱法测定化妆品中补骨脂酚的不确定度评定［J］. 化学分析计量，2024，33（10）： 114. (LI Li, WANG Jishuang, WANG Haiyan. Uncertainty evaluation for determination of bakuchiol in cosmetics by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 114.)