摘 要： 介绍了减肥类保健食品中酚酞、西布曲明基体标准物质的研制过程。采用阴性加标的方式，向保健食品模拟基质中添加酚酞、西布曲明标准溶液，混匀后分装制成保健食品标准样品。采用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法对其中酚酞、西布曲明的含量进行检测，并对样品中酚酞、西布曲明含量的均匀性和稳定性进行评价，5家实验室协作定值，评估定值的不确定度。研制的减肥类保健食品中酚酞、西布曲明基体标准物质定值结果分别为（19.8±2.95）、（18.8±3.03） mg/kg，均匀性和稳定性良好。研制流程和结果符合基体标准物质定值的要求，该标准物质可用于相关基质样品检测的实验室内部质量控制。

 

关键词： 标准物质制备； 减肥类保健食品； 高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法； 酚酞； 西布曲明； 不确定度

 

近年来，随着公众对纤细体态的追求，减肥类保健食品的消费逐年递增。然而，一些不法商家采用在减肥类保健食品中非法添加减肥药物的方式，营造起效迅速的减肥效果而牟利。这种行为违反了《食品安全法》中关于“生产经营的食品中不得添加药品”的规定，也对误食上述保健食品的人群的身体健康造成了一定的影响。酚酞作为接触性泻药，长期使用会引起腹泻、电解质失衡等不良反应；西布曲明是食欲抑制剂，长期使用会增加心血管疾病的风险[1]。上述两种药物均为已纳入监管的保健食品非法添加药物，是减肥类保健食品的必检项目。

保健食品非法添加药物的检测样品处理方法包括溶剂萃取法[2-4]、固相萃取法[5]、加速溶剂萃取法[6]等。其中，溶剂萃取法操作简便，可以满足常规保健食品检测的需求[7]。用于保健食品非法添加药物的检测方法包括薄层色谱法[8]、液相色谱法[9]及其与其他检测器联用的方法。由于非法添加药物的添加量有较大的随意性，并且药物种类来源多样，因此具备高灵敏度、高选择性、高通量等特点的高效液相色谱-质谱联用法，已成为保健食品非法添加检测最常用的检测方法之一[10]，也是BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的测定》、BJS 201710《保健食品中75种非法添加化学药物的检测》等标准检验方法中指定的检测方法。

使用“基体标准物质同时测定”是一种较为可靠的内部质量控制手段。近年来，越来越多的检验机构要求检验人员在分析样品时同时检测相应的基体标准物质，以验证检测结果的可靠性。目前，我国在保健食品非法添加类标准物质方面的品类仍较为稀缺，保健食品基体标准物质市场长期处于供不应求的状态[11-15]。

笔者结合标准物质研制及定值的相关标准和相关研究先例，介绍了减肥类保健食品中酚酞和西布曲明基体标准物质的研制过程。通过调研选择具有代表性的基质，以阴性基质加标的方式制成基质样品，使用食品安全国家抽检监督抽检指定方法进行检测，并经过均匀性、稳定性考察和5家实验室协作定值，满足基体标准物质的要求。该标准物质可用于相关检测的实验室内部质量控制，并维持分析量值的溯源链，为保健食品基质标准物质的研制提供了参考依据。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪：Xevo TQ-S型，美国沃特世科技有限公司。

电子天平：AL 204型，感量为0.000 1 g，瑞士-梅特勒-托利多集团公司。

离心机：HC-3018R型，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

酚酞标准物质：标准物质编号为100091-201802，质量分数为99.8%，中国食品药品检定研究院。

盐酸西布曲明标准物质：标准物质编号为100624-201802，质量分数为99.9%，中国食品药品检定研究院。

甲醇、乙腈、乙酸铵：均为质谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。

糊精：湖北武汉福鑫化工有限公司。

实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的一级水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Water HSS T3 C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流动相：pH 4.0的0.02 mol/L乙酸铵溶液-乙腈(体积比为56∶44)，流量为0.3 mL/min；洗脱方式：等度洗脱。

1.2.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(AJS-ESI源)；检测方式：多反应监测(MRM)模式；扫描方式：正离子模式；毛细管电压：3.5 kV；干燥器温度：350 ℃；干燥器流量：8 L/min；雾化器压力：206.8 kPa。

1.3 实验方法

1.3.1 减肥类保健食品中酚酞、西布曲明基体标准物质的制备

为使标准物质接近真实的保健食品，进行了市场调研，了解目前市售减肥类保健食品的基质及功效成分。市场上的剂型以固体片剂、硬胶囊剂和茶剂为主；功效成分多为具有相近功效的中药材。上述三种剂型的实际生产中，原料不需要特殊加工，仅加入必要辅料填充、成型即可。为使制备的保健食品基质适用于多数减肥类产品，最终选择使用频率较高的糊精作为基质，添加适量荷叶粉、泽泻粉制成模拟标准物质基质，以满足消除基体效应的要求。将酚酞、西布曲明标准物质溶于甲醇，制成标准溶液。将适量标准溶液添加至基质中，经晾干、粉碎、混匀、过筛等步骤，制成含酚酞、西布曲明20 mg/kg的减肥保健食品样品，分装为5 g/瓶，以棕色玻璃瓶密封、冷藏保存。

1.3.2 溶液制备

系列混合标准工作溶液：精密称取酚酞、盐酸西布曲明标准物质20 mg(精确至0.01 mg)，用甲醇溶解，并稀释成质量浓度为20 μg/mL的标准储备液。用甲醇逐级稀释制成5.0～100 μg/L的系列混合标准工作溶液。

样品溶液：称取1.3.1所研制标准物质样品0.5 g于50 mL离心管，加入45 mL甲醇，超声30 min，取出，冷却至室温，用甲醇定容至50 mL，涡旋混匀，静置5 min，取1.0 mL提取液至10 mL容量瓶中，用0.1%（体积分数）乙酸-甲醇混合溶液(体积比为50∶50)定容后混匀，取1 mL经0.22 μm有机滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.3 检测方法

使用仪器指定调协液调谐、优化电离源参数，将系列混合标准工作溶液和样品溶液等体积进样测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。以酚酞和西布曲明标准溶液的质量浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，以外标法定量。

1.4 样品均匀性和稳定性考察

根据JJF1343—2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》的规定，对样品的均匀性和稳定性进行评价。生产500瓶基体标准物质，连续编号，生成随机数表，从中随机抽取15个样品进行检测。每个样品的称取质量不低于0.5 g，平行测定2次。采用单因素方差分析进行均匀性考察，计算检测结果的F值(组间均方与组内均方的比值)。在95%置信区间内，若计算得出的F值小于查表得到的F值，则认为样品的均匀性可以满足要求。

按照先密后疏的原则，在6个月内设置4个时间点，分别对酚酞、西布曲明进行含量测定，考察样品长期稳定性。以均匀性检测结果作为稳定性基准，样品应避光、冷藏储存。分别在第1、2、4、6月依随机数表取样，每个时间点抽取样品3份，每份样品重复测定2次。采用趋势分析法，绘制各时间点取样检测结果的时间-质量浓度曲线，分析酚酞、西布曲明含量变化趋势。

将样品交付物流公司，实际邮寄至国内较远地区后寄回，以考察运输稳定性。随机抽取3份样品，将其按实际邮寄情况包裹后交付物流，邮寄至新疆维吾尔自治区，随后原路寄回。分别对上述运输样品中酚酞、西布曲明含量进行测定，每份样品重复测定2次。采用t检验对邮寄前后的样品含量变化进行考察。

1.5 定值方法

根据JJF1342—2022《标准物质研制(生产)机构通用要求》的规定，邀请4家有相应检验资质的实验室连同研制单位，采用多家实验室使用同种检验方法进行协作定值，采用统计方法确定定值结果。分别向每个定值实验室提供作业指导书、结果报告单及不少于4份的酚酞、西布曲明基质标准样品。要求各定值实验室每份样品平行测定2次，同时做加标回收率试验，最终提供有效检测结果不少于8个。

回收全部定值检测结果后，分别对每个成分的检测结果进行离群值检验，剔除离群的数据。采用格拉布斯检验对组内独立测量结果进行离群值检验；采用狄克森检验对组间数据进行离群值检验；采用科克伦检验对组间数据进行等精度检验。对全部独立检测结果进行正态分布检验。剔除离群值后，计算出各实验室检测结果平均值的总平均值，即样品的定值结果。

1.6 定值不确定度的评定

根据JJF1343—2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》的规定，根据实际情况选择相应方法评价标准物质定值不确定度。标准物质定值结果的不确定度主要由标准物质的均匀性引入的不确定度、标准物质稳定性引入的不确定度和标准物质定值过程引入的不确定度3个分量组成。以定值、均匀性、稳定性不确定度合成标准物质的合成相对不确定度，按95%的置信区间，取k=2，计算标准物质的扩展不确定度。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 均匀性检验结果

按1.4方法进行均匀性检验，采用单因素方差分析法对样品中酚酞和西布曲明测定结果进行统计。均匀性检验酚酞、西布曲明质量分数测定结果见表1，方差分析结果见表2。由表2可知，酚酞方差分析的F值为0.722，西布曲明方差分析的F值为0.591。查表得F0.05 (14，20)=2.42。酚酞和西布曲明的F值均小于F0.05(14，20)值，表明在95%置信区间内，研制的减肥类保健食品中酚酞、西布曲明基体标准物质的均匀性符合要求。

表1   均匀性检验酚酞、西布曲明质量分数测定结果

Tab. 1   Results of uniformity test for phenolphthalein and sibutramine mass fraction determination

 

 

 

表2   均匀性检验方差分析结果

Tab. 2   Results of variance analysis for uniformity test

 

2.2 稳定性检验结果

按1.4方法进行稳定性检验。以取样时间为横坐标，以稳定性各取样时间点的检测结果为纵坐标做线性拟合，并通过回归方差分析考察样品中目标物的稳定性。

稳定性检验结果见表3，长期稳定性检测回归方差分析结果见表4。由表3、表4可知，在95%的置信水平下，斜率的P值大于0.05，说明样品在考察期限内稳定性良好，以均匀性检测结果为稳定性基准，与运输样品的检测结果做t检验，结果t值均小于t双尾临界值，说明样品稳定性良好。

表3   稳定性检验结果

Tab. 3   Results of stability test

 

表4   长期稳定性检测回归方差分析结果

Tab. 4   Results of regression variance analysis for long-term stability testing

 

2.3 协作定值结果及离群值检验

按照“1.5定值方法”发放协作定值样品，回收各协作单位定值检测结果，见表5。

表5   协作定值检测结果(n=8)

Tab. 5   Results of collaborative calibration testing (n=8)

 

采用格拉布斯检验进行组内离群值检测。残差νi=xi-x̄，其中xi为测定值。当|νi|大于临界值λ(α，n)(与测量次数n及给定的显著水平a有关的数值，可查表得到)时，则xi被视为离群值，应予以剔除。样品的νi/s均小于λ(α，n)查表值，未观测到组内离群值。采用狄克森检验进行组间数据离群值检测。将测定数据按由小到大的顺序排列。对于5组数据，计算rn=(Xn-X(n-1))/(Xn-X1)，取其中较大者作为r值。若r值均小于显著性水平α和测量次数n对应的临界值f(α，n)，则保留所有数据。样品的r值均小于f(α，n)查表值，未观测到组间离群值。采用科克伦检验做组间数据等精度检验。C值为各单位数据方差的最大值与各单位方差和之比。样品各组测定数据的C值均小于临界值，各组数据等精度。全部数据符合正态分布，可以将总体平均值作为定值结果。

2.4 定值不确定度的计算

按1.6方法计算定值过程、均匀性、稳定性各不确定度分量，按95%的置信区间，取k=2，计算标准物质的扩展不确定度，结果见表6。所有定值结果服从正态分布且各组数据等精度，因此协作定值的不确定度可用总平均值的标准偏差来表征。

表6   酚酞、西布曲明基体标准物质各不确定度量值

Tab. 6   Uncertainty values of phenolphthalein and sibutramine matrix reference materials

 

由于待测物含量较低，方法重复性略差，均匀性检验方法分析的组内方差略大于组间方差，采用相应公式计算均匀性引入的不确定度。采用趋势分析法考察样品稳定性引入的不确定度。对稳定性检测结果做线性拟合，绘制各时间点稳定性检测结果的时间-质量分数拟合图，拟合直线的残差为单位时间内稳定性引入的不确定度。

2.5 保健食品中酚酞和西布曲明基体标准物质的定值结果

经过均匀性检验，6个月内的4个月次的稳定性检验和5家实验室协作定值，最终确定保健食品基体标准物质中酚酞的定值结果为(19.8±2.95) mg/kg，西布曲明的定值结果为(18.8±3.03) mg/kg。

 

3、 结语

 

介绍了减肥类保健食品中酚酞、西布曲明基体标准物质的研制过程。依照食品安全国家抽检监督抽检指定方法，采用高效液相-三重四级杆质谱法对样品中酚酞、西布曲明含量进行检测，并评价其均匀性和稳定性。该样品的均匀性和稳定性满足标准物质制备的要求。经5家实验室协作定值和不确定度评估，最终确定该基体标准物质中酚酞、西布曲明的定值结果分别为(19.8±2.95)、(18.8±3.03) mg/kg (k=2)。该标准物质可用于相关基质样品检测的实验室内部质量控制。

 

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引用本文： 李梦怡，王宏伟，王玉梅，等 . 减肥类保健食品中酚酞、西布曲明基体标准物质的研制［J］. 化学分析计量，2024，33（11）： 1. (LI Mengyi, WANG Hongwei, WANG Yumei, et al. Development of phenolphthalein and sibutramine standards for materials weight loss health supplements[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 1.)