三甲胺 (TMA) 具有刺激性的腥臭味，在评价动物性食物新鲜程度时被广泛使用。食品中的三甲胺主要来自于肉制品和水产品中氧化三甲胺的降解。氧化三甲胺具有特殊的鲜味，能给食物增加鲜美的口感，但宰杀后的肉制品和水产品中的氧化三甲胺极易在酶和微生物的作用下降解成三甲胺而散发出腥臭味。此外，三甲胺经食物进入人体后，可转化为致癌的N-亚硝胺类化合物，从而带来健康隐患。食品安全国家标准GB 2730—2015《食品安全国家标准 腌腊肉制品》规定了火腿中三甲胺的限量为25mg·kg−1。

     三甲胺含量的测定是评价水产品新鲜度、控制食品质量的重要手段。目前，已报道的三甲胺的检测方法有分光光度法、顶空气相色谱法、顶空气相色谱-质谱法、离子色谱法、传感器法、毛细管电泳法等，但都有其各自的局限性。随着多级质谱技术的快速发展，顶空气相色谱-串联质谱法被逐步推广使用，该方法具有灵敏度高、选择性强的特点，在小分子化合物的检测中具备得天独厚的优势，在食品检测领域倍受重视。

     研究人员探索了碱液的加入方式及其质量分数对三甲胺测定的影响，并优化了色谱、质谱条件，将顶空气相色谱 -串联质谱法应用到极性小分子化合物三甲胺的测定中，该方法简单、快速，灵敏度高，准确度好，可为三甲胺的检测提供参考。

1. 试验方法

     准确称取样品于离心管中，加入三氯乙酸溶液，均质后离心。上清液经脱脂棉过滤，滤液收集在容量瓶中。残留物分别用三氯乙酸溶液各提取一次，合并3次滤液，用5%三氯乙酸溶液稀释至刻度。

    准确移取上述样品溶液于顶空瓶中，压盖密封后用注射器从盖垫边缘准确注入氢氧化钠溶液，按照仪器工作条件测定。

2. 结果与讨论

2.1 氢氧化钠溶液的加入方式和质量分数的选择

     氢氧化钠可将样品溶液中的三甲胺盐酸盐转化为三甲胺气体，从而有利于顶空进样分析，但密封前直接加入固体氢氧化钠容易发生结块并产生大量热量，极易造成三甲胺气体逸出。因此，试验采用密封后注入氢氧化钠溶液的方式，不仅可以准确控制氢氧化钠的加入量，而且密封状态能有效地防止三甲胺气体逸出。准确移取样品溶液至顶空瓶并密封后，选择氢氧化钠溶液的注入点位至为关键。密封瓶盖中心是较为常用的注入点位，但氢氧化钠溶液在注入完毕并拔针后极易在穿刺孔附近残留，并在放置一段时间蒸发掉水分后形成白色粉末。顶空进样针从瓶盖中心位置再次穿刺进样时，残留的氢氧化钠不仅影响顶空瓶的气密性，还会污染顶空进样针，导致顶空进样针堵塞，给检测工作带来不确定性。当避开顶空进样针注入点位，从瓶盖边缘注入氢氧化钠溶液时，可以有效避免顶空进样针的污染和堵塞，且顶空瓶的气密性良好，满足顶空进样要求。

     试验进一步考察了不同质量分数的氢氧化钠溶液对5mg·L−1 三甲胺标准溶液中三甲胺峰面积的影响，如图1所示。

     根据试验结果，当氢氧化钠的质量分数不大于20%时，三甲胺结果的重现性较好（RSD不大于3.0%）。

      存储稳定性也是影响结果准确度的重要指标，将含5%，10%，20%氢氧化钠的5mg·L−1三甲胺标准溶液放置 24，96h后，三甲胺峰面积的变化情况见图2。

    结果表明，虽然高浓度水平的氢氧化钠可以提高三甲胺在顶空瓶中的转化率和溢出率，但其结果的稳定性、重现性较差。

    综上，试验选择在顶空瓶中添加的氢氧化钠溶液的质量分数为10%。

2.2 质谱条件的选择

     将三甲胺标准溶液恒温孵化后注入气相色谱-串联质谱仪，在m/z 30~70 内进行一级质谱全扫描，所得的质谱图如图3所示。

     在扣除质谱背景后，目标物在 m/z 58，59，42处出现特征碎片，这与 NIST标准质谱数据库和相关文献报道相吻合，综合考虑质谱响应情况和抗干扰能力，选择 m/z 58，59作为前体离子进行二级质谱研究。根据结果将m/z 58/42作为定量离子对，另外一个m/z 58/30作为定性离子对；m/z 59的产物离子m/z 43响应较大，将m/z 59/43选作定性离子对。试验进一步比较了上述 3个特征离子对在不同碰撞能量下的相对强度，结果如图4所示。

    根据结果，试验选择在上述3个碰撞能量下进行二级质谱检测，所得3个特征离子对的提取离子色谱图如图5所示。

2.3 分流比的选择

     分流比是影响三甲胺峰形和分离度的关键因素，试验考察了不同分流比对三甲胺出峰情况的影响，结果如图6所示。

     结果显示，三甲胺的保留时间随分流比的增大而缩短，在分流比不大于20∶1时出现了平顶峰或圆顶峰，这可能与大量三甲胺在进样口未被分流而进入质谱检测器造成的过载现象有关。统计了三甲胺在不同分流比下的色谱峰特征参数，如表1所示。

表1 不同分流比下三甲胺的色谱峰参数

    结果显示：当分流比不小于40∶1 时，三甲胺峰形均为对称尖峰，但是其峰面积和峰高均随着分流比增大而减小。考虑到分流比在40∶1时三甲胺的半峰宽相对较宽，容易产生干扰，试验选择的分流比为60∶1。

2.4 平衡温度和平衡时间的选择

     平衡温度和平衡时间是影响检测效率和能耗的重要因素，试验考察了三甲胺在不同平衡温度下的响应强度。考虑到平衡温度为45℃时质谱响应强度相对 40℃时的显著提升，试验选择的平衡温度为45℃。

     试验考察了在平衡温度45℃下平衡不同时间时三甲胺的相对强度，结果如图7所示。

     根据试验结果，综合考虑检测效率、能耗以及结果的重现性，试验选择的平衡时间为40min。

2.5 标准曲线和检出限

     取三甲胺标准溶液系列各2.0mL，分别置于20mL顶空瓶中，压盖密封后用注射器从盖垫边缘准确注入氢氧化钠溶液，按照仪器工作条件测定。以定量离子对峰面积为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明，三甲胺的质量浓度在0.2~50mg·L−1内和对应的定量离子对峰面积呈线性关系，强制过零点，所得的线性回归方程为 y=6141x，相关系数为0.9997。

     以 3 倍的信噪比（S/N）计算检出限（3S/N），所得结果为0.3mg·kg− 1。

2.6 精密度和回收试验

     按照试验方法对空白样品进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平进行6次平行测定，以考察方法的准确度和精密度。结果表明方法具有良好的准确度和精密度，适用于水产品中三甲胺的测定。

2.7 样品分析

     在市场购买3批新鲜鱼肉样品，按照试验方法测定。结果显示：在3批样品中均未检出三甲胺。将鱼肉样品在冷冻和冷藏条件下储存不同时间，根据结果推测冷藏条件下微生物在鱼肉中大量繁殖，鱼肉蛋白质在酶和微生物的作用下降解成三甲胺，导致样品出现刺激性腥臭味。

3. 试验结论

     研究人员采用顶空气相色谱-串联质谱法测定水产品中三甲胺的含量，方法具有以下优点：一是改进了氢氧化钠溶液的注入点位，与顶空进样针的穿刺点位形成错位，避免发生进样针堵塞现象；二是优化了碱的加入方式，在准确控制碱用量的同时避免了三甲胺气体的逸出，结果的准确性和重现性得到显著提升；三是采用灵敏度高、选择性好的串联质谱进行了MRM分析，提高了定性定量结果的准确度。该方法很好地弥补了单级质谱检测器对小分子化合物定性定量分析的劣势，为水产品中三甲胺的测定提供了有益参考。

作者：郑耀林 1，卢贵婷 1,2，林秋凤 1，莫淑梅 1，杨乐 1，张树权 1

单位：1. 东莞市食品药品检验所；

2. 广东海洋大学 食品科技学院

来源：《理化检验-化学分册》2024年第12期