流式细胞术的测定对象是单细胞或单个微粒，在FCM技术中能够制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节，单细胞悬液来自于动植物的不同组织器官，也可来自于非生物样品，FCM中大多数为生物样品，生物样品主要来源于培养细胞、血液、新鲜实体组织以及石蜡包埋组织等，不同的组织有不同的单细胞分散方法，因此建立切实可行的FCM单细胞悬液的具体制备方法，在流式细胞分析中至关重要。

 

1、新鲜实体组织单细胞悬液制备

 

FCM对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上，根据不同实体组织成分的特点，下面介绍几种单细胞悬液制备方法，仅供参考。

 

(一)酶消化法

 

酶的作用原理主要有三方面：一是破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等，二是水解组织细胞的紧密连接结构的蛋白质，三是水解组织间的粘多糖物质。酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法之一。

 

酶消化法常规程序如下:

 

1.将适合于酶消化的组织置于离心管中。

 

2.将选好的酶溶液1~2ml加入盛有被消化组织的试管中。

 

3.常规消化20~30min(恒温37℃或室温)，消化期间间断振荡或吹打。

 

4.终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团快，以低速离心除去细胞碎片。

 

5.加入PBS 2ml充分混匀，离心弃掉上清，再加入0.5ml PBS重悬细胞。

 

6.将制备好的单细胞悬液进行荧光标记后上机检测或保存备用。

 

(二)机械法

 

机械法分散实体组织包括:用剪刀剪碎组织或用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，用细注射针头反复抽吸细胞等，最后用300目尼龙网过滤细胞得到单细胞悬液。

 

1.剪碎法

 

(1)将组织快放入平皿中，加入少量生理盐水。

 

(2)用剪刀将组织剪至匀浆状。

 

(3)加入10ml生理盐水。

 

(4)用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管内。

 

(5)离心沉淀1000rpm/min，4~5min，再用生理盐水洗3次，每次以短时低速（500~800rpm/min)离心沉淀去除细胞碎片。

 

(6)以300目尼龙网过滤去除细胞团块。

 

(7)选择适当的固定液(70%冰乙醇等)固定细胞或低温保存备用。

 

2.网搓法

 

(1)将100目、300目尼龙网扎在小烧杯上。

 

(2)把剪碎的组织放在网上，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。

 

(3)收集细胞悬液，离心沉淀细胞500~800rpm/min，2分钟。

 

(4)固定细胞或低温保存备用。

 

3.研磨法

 

(1)先将组织剪碎成1~2mm 3小块。

 

(2)放入组织研磨器中加入1~2ml生理盐水。

 

(3)转动研棒，研至匀浆。

 

(4)加入10ml生理盐水，冲洗研磨器。

 

(5)收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀细胞，500~800rpm/min，2min，再以生理盐水洗3遍，离心沉淀。

 

(6)固定或低温保存细胞，备用。

 

(三)化学处理法

 

化学处理法的主要原理是:将组织细胞间起粘连作用的钙、镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。

 

(1)将组织切成薄片，置入试管。

 

(2)首先加入EDTA液5ml，室温下0.5小时，离心弃之。

 

(3)加入胰酶-EDTA液5~10ml，置37℃恒温水浴30min，间断振荡3~5次。

 

(4)用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000rpm/min，5min，再以生理盐水洗2~3次，离心500~800rpm，1~2min。

 

(5)将细胞固定或低温保存备用。

 

上述几种方法都是目前对实体组织解聚的常用方法。要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。

 

注意事项：

 

①需要注意的是酶学方法的使用条件和影响因素(如酶浓度、酶效价、作用时间、pH值)等，例如胃蛋白酶在碱性环境下失去活性、胰酶在中性溶液中活性欠佳。

 

②采用网搓法同样也可获得大量细胞，但机械法容易造成细胞碎片和细胞团快，因此常与其他方法配合使用。

 

③新鲜组织标本应及时处理保存，避免细胞自溶导致DNA降解。

 

④根据实验目的选择最佳固定方式;如采用酶学法需注意酶的溶剂、消化时间、pH值、浓度等，同时根据组织成分合理选用酶类，例如含大量结缔组织肿瘤，如食管癌、乳腺癌、皮肤癌等应选择胶原酶。

 

2、石蜡包埋组织单细胞悬液制备

 

石蜡包埋组织单细胞悬液的制作方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，并有大量临床随访资料，因此非常有利于进行回顾性研究和利用。下面介绍常用石蜡包埋组织单细胞悬液制备方法。

 

1.切片:将石蜡包埋组织切成40~50μm厚3~5片，放入10ml试管中。

 

2.脱蜡:加入二甲苯5~8ml脱蜡(室温)1~2天，视石蜡脱净与否，更换1~2次二甲苯，待石蜡脱净后弃掉二甲苯。

 

3.水化:依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步10min，去乙醇，加入蒸馏水3~5ml，10min后弃之。

 

4.消化:加入2ml0.5%胃蛋白酶(pH1.5~2.0)，置37℃恒温水浴中消化30min，消化期间每隔10min振荡1次。

 

5.终止消化:消化30min后立即加入生理盐水。

 

6.经300目尼龙网过滤:未消化好的组织可做第2次消化。

 

7.离心、漂洗:收集细胞悬液，离心沉淀1500rpm/min，5min，再以生理盐水漂洗1~2次，离心沉淀500~800rpm/min，去碎片。

 

8.低温保存细胞备用。

 

注意事项:

 

①切片不宜过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响流式分析结果，过厚则脱蜡不净或脱蜡时间过长。一般适宜厚度为40~50μm;

 

②必须将石蜡脱干净，检验石蜡是否脱净的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果无絮状物漂浮可视为蜡已脱净，反之则未脱净;

 

③消化时间不宜过长，以避免细胞核被消化溶解;

 

④消化后的组织先用剪刀剪碎后再消化或将组织片放在300目尼龙网上，用圆滑底部的试管磨碎，再用PBS冲洗，如此反复就可得到较多的细胞。

 

3、培养细胞的单细胞悬液制备

 

培养细胞一般以悬浮或贴壁方式生长。对悬浮生长细胞先用吸管反复吹打的方式分散聚团的细胞，然后常规洗涤、低速离心法去碎片、沉淀细胞，再次悬浮即可获得单细胞悬液。

 

下面主要介绍贴壁生长细胞单细胞悬液制备方法。

 

1.消化:将培养细胞用0.04%乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA·2Na)或0.29%胰蛋白酶消化3~7min(据室温情况灵活掌握)，在显微镜下见到贴壁细胞之间出现筛状间隙为止，弃去消化液，加PBS液。

 

2.收集细胞:用吸管将细胞从瓶壁上轻轻吹打下来，移入离心管中。

 

3.低速离心:即800~1000rpm/min，5min。弃上清，

 

4.反复漂洗、离心:加PBS(pH 7.4) 5~8ml混匀，低速离心，同上。重复2~3次

 

以去除细胞碎片。

 

5.获得单细胞悬液:加少许PBS将沉淀细胞轻轻吹打均匀，即可获得单细胞悬液。

 

6.低温保存或固定细胞备用。

 

4、外周血单细胞悬液制备

 

在生理状态下，血液中细胞成分呈分散的游离状态，因此血细胞是FCM最合适的样品，血细胞成分包括红细胞、白细胞和血小板等有形成分，白细胞包括淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。流式细胞术主要是对某一类细胞群为对象，因此常常把某一群细胞单独分离出来做分析。一般采集抗凝血样后，样本管平行放置在18~25℃室温下保存，6h之内处理。根据不同实验目的选择合适的抗凝剂，比如EDTA-K₂或EDTA-K3抗凝剂终浓度为1.5~2mg/ml，肝素抗凝剂为1000U/ml。下面介绍几种血液单细胞成分制备方法，仅供参考。

 

(一)单个核细胞制备

 

1.取肝素抗凝血2ml，用生理盐水2ml稀释至 4ml。

 

2.取3ml淋巴细胞分离液放入10ml离心管中，再将4ml稀释好的血沿试管内壁缓缓加入到分离液面之上，保持清晰的分层状态，切勿用力过大导致血液和分离液混合。

 

3.室温(18~20℃)下，离心2000rpm/min，30min。离心后可见试管内的血液清晰地分为4层:上层为血浆;中层为分离液;上层和中层之间白色薄层为淋巴细胞层;底层为红细胞层;红细胞层上面为粒细胞层。

 

4.用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞吸出，收集到另一离心管中，用生理盐水或Hank 液稀释至10ml。

 

5.离心洗涤2次，每次均以1500rpm/min，10min，弃上清后加入少许生理盐水或培养液，即得到大量单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，包括高纯度的淋巴细胞和单核细胞。

 

6.固定细胞或置4℃冰箱保存备用。

 

(二)单核细胞制备

 

1.在无菌条件下，取肝素(1000U/ml)抗凝全血3ml，加入3ml生理盐水将血稀释。

 

2.取 1640 培养液10ml加入培养皿中，再加入已稀释的血混匀后放入恒温箱内孵育30~40min，注意加大液体与培养皿接触面。

 

3.取出培养皿，将血倾倒掉，用生理盐水轻轻冲洗一次培养皿，去掉残留的血液，此时培养皿壁上贴附了大量单核细胞。单核细胞具有短时间内易贴壁的特性，而其他细胞不贴壁，根据这个特性可获得较纯的单核细胞。

 

4.室温下，用0.25%胰蛋白酶消化10~15min，通过不断摇震或用橡皮刷轻刮瓶壁方式，促使细胞脱落下来，切勿用力过大导致细胞损伤过多。

 

5.离心沉淀脱落细胞，1500rpm/min，5min，再以生理盐水漂洗2~3次，每次离心800rpm/min，3min，去除碎片杂质，即可获得较多的单核细胞。

 

6.将细胞固定或低温保存备用。

 

(三)粒细胞制备

 

1.用淋巴细胞分离液对外周血分层(参见单个核细胞制备)。

 

2.粒细胞层位于分离液底部、红细胞之上。以吸管轻轻吸出粒细胞层，置另一个离心管中，加入5ml Hank液洗涤3次，每次离心1500rpm/min，10min。

 

3.加入2ml低渗液(Hypotonic Lysis)30~40秒，以去除红细胞。

 

4.再以 Hank液洗涤2次，即可获得高纯度粒细胞。

 

5.将细胞固定或低温保存备用。

 

5、骨髓有核细胞悬液的制备

 

1.抽取骨髓0.5ml，滴入含肝素(1000U/ml)抗凝剂的2ml PBS 液中。

 

2.再加入 PBS液稀释至4ml。

 

3.将稀释的4ml骨髓液缓慢加入到盛有3ml人类淋巴细胞分层液面之上，避免骨髓液与分层液混合。

 

4.离心沉淀2000rpm/min，20min。此时淋巴细胞、单核细胞、髓性细胞、白血病细胞等有核细胞层位于PBS和淋巴细胞分层液之间。

 

5.吸取有核细胞层，加入至10ml PBS液中混匀。

 

6.离心沉淀细胞，1000rpm/min，5min，弃上清。

 

7.加固定液或少量PBS液，置低温冰箱保存备用。

 

6、活检、内镜取材标本单细胞悬液制备

 

对肿瘤组织、淋巴结等活检组织以及各种镜检取材标本均可做单细胞悬液，因标本量少，制备起来较麻烦，一般镜检取材标本至少取3块以上，制备方法与实体组织基本类似。

 

1.取下来的组织立即放入盛少许PBS的青霉素小瓶中。

 

2.另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住，用线绳固定好，并用PBS液湿润，取下的标本放在尼龙网上。

 

3.用PBS液湿润剪刀，反复剪碎组织，待无明显组织块时，用先前的小瓶中的PBS 冲洗匀浆并过滤于小烧杯中，如果仍见组织块继续剪碎，再冲洗，直至网上无组织块为止。

 

4.得到的细胞固定或低温保存备用。

 

7、脱落细胞的单细胞悬液制备

 

在临床工作中我们常常会遇到脱落细胞检查，比如宫颈脱落细胞、食管拉网脱落细胞、胸腹水以及尿液脱落细胞等，从中收集脱落细胞做各种荧光抗体标记后进行FCM检测，这对临床诊断和治疗很有意义。

 

(一)宫颈脱落细胞

 

1.首先用生理盐水冲洗宫颈表面分泌物，以海绵轻拭宫颈表面，将海绵上吸附的脱落细胞洗脱到20ml生理盐水中。

 

2.收集细胞悬液离心沉淀，1500rpm/min，5min，再用生理盐水洗涤2次。

 

3.弃上清后加入70%乙醇固定或低温保存备用。

 

(二)食管拉网脱落细胞

 

1.将拉网器上的脱落细胞洗脱到10ml生理盐水中，先在1500rpm/min，5min条件下离心沉淀，再用生理盐水洗涤2次，800rpm/min，2min，弃上清。

 

2.再加入生理盐水5ml，以300目尼龙网过滤，离心沉淀去上清。

 

3.加少许生理盐水混匀细胞，低温保存或固定备用。

 

(三)尿液脱落细胞

 

1.用清洁器皿收集24h尿液，置4℃冰箱中自然沉淀细胞，轻轻倒去上清液，留下少许含细胞的沉淀物，用吸管移至20ml离心管中，离心500rpm/min，10min，弃上清。

 

2.加 PBS液10ml混匀后离心，1000rpm/min，10min，去上清，再重复洗一次。

 

3.加5ml PBS混匀，用300目尼龙网过滤，离心沉淀去上清。

 

4.加少许 PBS 混匀，加固定液或低温保存备用。

 

(四)胸、腹水脱落细胞

 

1.抽取胸、腹水200~300ml，加入1000U/ml肝素钠5ml，置6~12小时后弃上清。

 

2.吸取沉淀液20ml入试管内，用PBS液洗3次，1500rpm/min，5min。

 

3.再加5ml PBS液混匀，用300目尼龙网过滤后离心沉淀去上清。

 

4.加少许 PBS 液混匀，加固定液或低温保存备用。

 

参考资料：

 

https://umanitoba.ca/health-sciences/research/flow-cytometry

https://images.app.goo.gl/jsq6fnEiPKSpeHtB6

https://images.app.goo.gl/mcFiQouZK2zuAUmh9

 

https://images.app.goo.gl/tquLCNNpRDN99bURA