本研究旨在消除 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性，并开发一种用于 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的微生物计数方法，以评估该滴眼液样品的微生物计数方法的适用性。研究方法包括采用聚偏二氟乙烯（PVDF）无菌滤膜对 0.5% 左氧氟沙星滴眼液供试液进行薄膜过滤，随后用 500 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次冲洗液用量为 50 mL。在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌菌液，进行过滤、贴膜和培养计数。研究结论表明，通过使用聚偏二氟乙烯（PVDF）无菌滤膜过滤 0.5% 左氧氟沙星滴眼液供试液，可获得较高的微生物回收率（111%），有效消除了 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性。因此，该方法适用于 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的微生物计数方法适用性试验。

1.引  言

0.5% 左氧氟沙星滴眼液是一种广谱抗菌滴眼液。左氧氟沙星的化学式为 C18H20FN3O4，属于喹诺酮类药物，在水中微溶。体外试验表明，左氧氟沙星对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌展现出显著的抗菌活性。具体而言，它对葡萄球菌属、链球菌属（包括肺炎球菌）、细球菌属、肠球菌属、棒状杆菌属等革兰阳性菌，以及假单胞菌属（包括绿脓杆菌）、流感嗜血杆菌、莫拉氏菌属、沙雷氏菌属、克雷白氏菌属、变形杆菌属、不动杆菌属、肠杆菌属等革兰阴性菌均具有较强的抗菌作用。

根据《中国药典》四部 1105 表 2，针对常见干扰物的中和剂或灭活方法，喹诺酮类抗生素的中和剂可选用镁或钙离子[1]。龙慧 [2] 等人在进行盐酸左氧氟沙星片微生物限度检查法的方法学研究时，选用硫酸镁作为中和剂，以进行盐酸左氧氟沙星片的微生物测试。万进 [3] 等人在进行盐酸左氧氟沙星凝胶微生物限度检查方法验证时，采用钙离子（Ca2+）来中和喹诺酮类抗菌药物的抗菌活性。舒静 [4] 等人在进行盐酸左氧氟沙星胶囊微生物限度检查方法学验证时，联合使用离心沉淀集菌法、薄膜过滤法及中和法，以去除盐酸左氧氟沙星胶囊的抑菌活性。孙伟 [5] 等人以 β 环糊精作为中和剂，采用薄膜过滤法对喹诺酮类抗生素药品进行微生物限度方法学研究。

上述研究均采用中和剂来消除左氧氟沙星的抗菌活性，但中和剂的配置过程较为复杂，且在方法适用性试验中需要增设中和剂对照组，这使得方法适用性试验和后续供试品的测试操作较为复杂，增加了工作量。本文提出了一种新的试验方法，通过将常用的混合纤微素膜（MCE）无菌滤膜更换为聚偏二氟乙烯（PVDF）无菌滤膜，有效消除了左氧氟沙星的抗菌活性。该方法操作简便，试验结果良好，不仅提升了试验效率，还减少了因操作步骤复杂可能导致的微生物污染风险。

2.消除抑菌活性的方法

在微生物测试方法适用性试验中，供试品的抑菌活性是一个难点。目前，常用的消除抗菌活性的方法包括稀释法、薄膜过滤法、化学中和法和离心沉淀法。对于抑菌性较强的供试品，可以联合使用上述方法以更有效地去除抗菌活性。为便于比较，表1 汇总了各消除抗菌活性方法的特点。

表1 抗菌活性的去除或灭活

3.试验程序

本部分将详细介绍进行试验的具体步骤和方法，以确保试验的准确性和可重复性。下文会提供一系列的指导原则和操作流程，帮助实验者理解并遵循正确的试验程序，从而获得稳定和一致的试验结果。

3.1样品信息

在试验开始之前，需要对样品进行详细的记录和分类，包括样品的来源、类型、名称等关键信息，如表2所示。这些信息为试验的顺利进行提供了有力的数据支持。

表2 样品信息

3.2试验仪器和材料

在进行科学试验或技术测试时，选择恰当的试验仪器和材料至关重要。试验仪器涵盖了各种精密测量设备、分析仪器等，它们对于准确获取试验数据、确保试验结果的可靠性和可重复性起着决定性作用。同时，试验材料的选择也极为重要。试验材料包括试验过程中使用的试剂、样品、耗材等，其纯度、稳定性和一致性直接关系到试验的准确性和有效性。关于主要设备、耗材、培养基和试剂、试验菌株的详细信息，请参见表3、表4、表5和表6。

表3 主要设备

表4 耗材

表5 培养基和试剂

表6 试验菌株

3.3方法开发试验

3.3.1 试验步骤

取 1 mL 0.5% 左氧氟沙星滴眼液样品，转移至 9 mL pH 7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液中，充分混匀，制备成1:10 的供试品溶液。

首先，使用适量的冲洗液对过滤器的滤膜进行预冲洗，确保滤膜充分润湿。随后，将上述制备好的 1:10 供试品溶液进行过滤。用 1000 mL pH 7.0无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 50 mL。在最后一次冲洗中加入 102 ～ 103 CFU/mL 的金黄色葡萄球菌菌液 100 μL ，继续过滤。过滤完成后，将滤膜贴到 TSA 平板上，将平板倒置于 30 ～ 35 ℃的环境中培养，时间不超过 3 天。

3.3.2 不同试验条件的对比

使用不同浓度的含中和剂的 pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液、含中和剂的 TSA 平板、MCE 无菌滤膜和PVDF 无菌滤膜，按照上述步骤进行试验。具体的试验组合方式和试验结果详见表7 和表8。

由表7 和表8 可知，使用含 0.1 mol/L硫酸镁中和剂的 pH 7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液和含 0.1 mol/L 硫酸镁中和剂的 TSA 平板，并未能有效去除 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性。然而，将 MCE 无菌滤膜更换 为 PVDF 无菌滤膜后，试验结果显示出明显的差异；在不使用硫酸镁中和剂的情况下，仅通过将滤膜由MCE 无菌滤膜更换为 PVDF 无菌滤膜，0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性得到了有效去除，且微生物生长状况优于使用硫酸镁中和剂的试验组。

表7 方法开发试验1组

表8 方法开发试验2组

常规供试品薄膜过滤通常选用混合纤微素膜（MCE）无菌滤膜。MCE滤膜由硝酸纤维素和醋酸纤维素制成，具有孔隙率高，孔径分布均匀，微孔阻力小，截留效果好，滤速快等特点，广泛应用于分析和研究领域。然而，MCE 无菌滤膜不耐有机液体和强酸碱溶液。

聚偏二氟乙烯（PVDF）无菌滤膜具备诸多优异性能：高机械强度和韧性、抗真菌性、高耐磨性、高渗透性、良好的热稳定性和阻燃性，以及耐化学腐蚀性和抗氧化性。此外，它还具有最低的蛋白吸附和优秀的化学兼容性，确保了结构的完整性。

使用 MCE 无菌滤膜时，0.5% 左氧氟沙星滴眼液中的左氧氟沙星无法被完全过滤，会在滤膜中残留，从而抑制微生物的生长。而 PVDF 无菌滤膜具有较低的吸附性，能够有效地过滤供试品溶液中的左氧氟沙星抑菌剂，消除左氧氟沙星的抑菌性能，使得微生物能够良好生长。

3.4试验步骤

3.4.1 试验组

取 1 mL 0.5% 左氧氟沙星滴眼液样品，转移至 9 mL pH 7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液中，充分混匀，制备成1:10 的供试品溶液。

首先，使用适量的冲洗液对过滤器的滤膜进行预冲洗，确保滤膜充分润湿。随后，将上述 1:10 的供试品溶液进行过滤。接着，依次使用 500 mL、800 mL、1000 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 50 mL。在最后一次冲洗液中加入102 ～ 103 CFU/mL 的金黄色葡萄球菌菌液 100 μL ，继续过滤。过滤完成后，将滤膜贴到 TSA 平板上。

3.4.2 供试品对照组

取 1 mL 0.5% 左氧氟沙星滴眼液样品，转移至 9 mL pH 7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液中，充分混匀，制备成1:10 的供试品溶液。

首先，使用适量的冲洗液对过滤器的滤膜进行预冲洗，确保滤膜充分润湿。随后，将上述 1:10 的供试品溶液进行过滤。接着，依次使用 500 mL、800 mL、1000 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 50 mL。在最后一次冲洗液中加入 pH 7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液100 μL，继续过滤。过滤完成后，将滤膜贴到 TSA 平板上。

3.4.3 菌液对照组

取 1 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液加入至 9 mL pH 7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，充分混匀，制得 1:10 的样品溶液。

首先，使用适量的冲洗液对过滤器的滤膜进行预冲洗，确保滤膜充分润湿。随后，过滤上述制备的样品溶液。接着，分别用500 mL、800 mL、1000 mL pH 7.0的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每次冲洗液用量为 50 mL。在最后一次冲洗液中加 102 ～ 103 CFU/ml 的金黄色葡萄球菌菌液 100 μL，然后进行过滤。过滤结束后，将滤膜贴到 TSA平板上。

3.4.4 阴性对照组

取 1 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液加入至 9 mL pH7.0 的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液中，充分混匀，制得 1:10 的样品溶液。

首先，使用适量的冲洗液对过滤器的滤膜进行预冲洗，确保滤膜成分润湿。随后，过滤上述制备的样品溶液。接着，用 1000 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液分次对滤膜进行冲洗，每次冲洗液用量为 50 mL。过滤结束后，将滤膜贴到 TSA 平板上。

3.4.5 培养

贴膜后的 TSA 平板应倒置于30 ～ 35℃的培养环境中，时间不超过3 天。

3.4.6 结果解释

在试验中，试验组的回收率在50% ～ 200% 的范围内，且阴性对照组无菌生长。回收率计算公式为：

3.5数据结果和分析

根据上述试验数据，使用 PVDF 无菌滤膜薄膜过滤，并分别采用 500 mL、800 mL 和 1000 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液进行冲洗，每次冲洗液用量为 50 mL。在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌菌液，能够获得较高的微生物回收率，有效地消除了 0.5%左氧氟沙星滴眼液的抑菌性。试验结果（见表9）显示，使用 500 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液冲洗时，微生物回收率为 111%，符合试验组回收率在 50% ～ 200% 范围内的要求。考虑到尽量减少冲洗量以降低对微生物生长的潜在影响，最终选择 500 mL pH 7.0的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液作为 0.5%左氧氟沙星滴眼液微生物计数法的冲洗量，以进行方法适用性试验。

表9 试验数据结果和分析

4.结  论

使用 PVDF 无菌滤膜薄膜过滤，配合 500 mL pH 7.0 的无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液冲洗，每次冲洗液用量为50 mL，在最后一次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌菌液进行过滤。过滤结束后，将滤膜贴到 TSA 平板上进行倒置培养和计数。此方法能够获得较高的微生物回收率（111%），有效地消除 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的抗菌活性，因此该方法适用于 0.5% 左氧氟沙星滴眼液的微生物计数方法适用性试验。

参考文献

[1] 国家药典委员会 . 中国药典 2020年版·二部 [Z]，2020.

[2] 龙慧，吴鑫，鄢雷娜，陈芳 . 盐酸左氧氟沙星片微生物限度检查法的方法学研究 [J]. 中国药房，2014 年.

[3] 万进，林蒙，谢委，王文清 . 盐酸左氧氟沙星凝胶微生物限度检查方法验证 [J]. 医药导报，2015 年.

[4] 舒静，谢艳娇，邝少轶，张丽 . 盐酸左氧氟沙星胶囊微生物限度检查方法学验证 [J]. 健康必读（中旬刊），2013.

[5] 孙伟，刘文杰，崔颖，牛振东，高 春 .β- 环糊精在喹诺酮类抗生素药品微生物限度检查方法建立中的应用 [J]. 药物分析杂志，2013.

本文作者刘晓婵，江苏艾苏莱生物科技有限公司，仅供交流学习。