导语

 

近年来，随着细胞和基因治疗等新技术的发展，耳科新药的研究也开启了新的篇章。之前没有治疗方法的一些耳科疾病，现在也有了可以让患者重新恢复听觉的方法和治疗手段。这些新的治疗方法的出现，也为非临床研究提出了更高的要求和更新的评价方法。

 

首先，精准的耳局部给药是耳科药物非临床研究中的关键环节。其次，听觉电生理检测技术是非临床研究中评价听觉系统功能与病理机制的重要手段，其在基础研究与临床转化中具有不可替代的作用。听觉电生理技术结合精准的耳局部给药策略，为解析听觉疾病机制及开发新型治疗药物提供了多维度的研究平台。基于实验动物模型的听觉功能评估，结合听觉脑干诱发电位与畸变产物耳声发射检测技术，可精准解析听觉传导通路的电生理特性。本文简要阐述在非临床研究中实验动物的耳局部给药技术、听觉电生理数据检测方法及结果分析要点，为耳科疾病动物模型构建与耳科药物研究提供参考。

 

耳部给药技术

 

1.耳的解剖

耳的解剖结构分为外耳、中耳和内耳。外耳包括耳廓和外耳道。中耳介于外耳和内耳之间，是位于颞骨中的不规则含气腔和通道。包括鼓室、咽鼓管、鼓窦和乳突。中耳内含听小骨，即锤骨、砧骨和镫骨。内耳又称迷路，埋藏于颞骨岩部，结构复杂且精细，内含听觉和前庭器官，按解剖和功能分为前庭、半规管和耳蜗3个部分。耳蜗位于鼓室内壁的颞骨岩部，并嵌入颞骨岩部。与大鼠或犬相比，耳蜗在豚鼠中更明显并更大程度向鼓室突出，在灵长类动物中几乎完全包含在颞骨内。在豚鼠中表现为螺旋状或“蜂巢状”。内耳按组织学可分为骨迷路和膜迷路，膜迷路内有听觉与位觉感觉器。骨迷路和膜迷路之间充满外淋巴液，而膜迷路中充满内淋巴液，内、外淋巴液互不相通。    

 

人类与实验动物的耳部解剖差异主要体现在形态适应性（如耳廓形状）、功能特异性（如听力频率范围）和生理响应（如耳毒性敏感性）等多个层面，但结构组成大体一致。

 

 

2.耳部生物屏障

 

不同耳局部给药途径需要克服外耳道、鼓膜及中耳/内耳的多重屏障，需根据病变部位（外耳、中耳或内耳）和药物性质选择适宜的给药策略。

 

鼓膜（Tympanic Membrane, TM）

 

鼓膜为椭圆形半透明薄膜，分隔外耳道与鼓室。鼓膜略向中央凹陷，形似喇叭。鼓膜由外表皮层、内粘膜层和含有胶原蛋白的中间纤维层等三层结构组成。由于鼓膜具有角蛋白和富含脂质的角质层，因此除了相对较小和中等亲脂性分子外，其他分子都无法透过鼓膜。

 

人及不同实验动物耳部鼓膜结构组成大致一致，但不同实验动物鼓膜面积不同，在某些参数上如厚度、倾斜角度上也存在差异，在选择实验动物进行研究时需要关注。

 

圆窗膜（Round Window Membrane, RWM）及卵圆窗（Oval Window）

 

RMW由三层结构组成：包括面向中耳和耳蜗鼓阶的上皮层和中间的结缔组织层，将中耳和鼓阶分开，分子量小、脂溶性高和带正电荷的药物易于透过。卵圆窗由镫骨足板封闭，它将前庭阶与中耳隔开。圆窗膜及卵圆窗阻碍了药物递送至耳蜗。

 

实验动物与人类在圆窗膜和卵圆窗的解剖结构和功能上存在一定差异，这些差异可能对听力研究、耳科手术或药物实验的设计产生影响。如想通过圆窗膜（RWM）内耳给药时必须考虑圆窗膜的空间立体结构，这样才能保证找到正确的角度以达到正确给药的目的。

 

血-迷路屏障（Blood Labyrinth Barrier, BLB）

 

血-迷路屏障是体循环和耳蜗之间的理化屏障，与血脑屏障相似，该屏障将内耳液体与血循环分开。小分子且脂溶性良好的药物相对容易通过血-迷路屏障，而带电荷的、水溶性的或具有高分子量药物一般较难通过血-迷路屏障。血-迷路屏障保护了耳部免受体循环中外源性和内源性毒素的损害，但也因此使药物从体循环递送至耳蜗变得相对困难。

 

基于以上，在选择给药方法时，不仅考虑药物的性质，也要考虑以上屏障对药物的渗透和代谢的影响。

 

3.耳部给药途径

 

耳局部给药需结合病变部位、药物的理化性质以及实验动物解剖学特点选择递送路径：

 

★外耳给药

 

将药物滴入外耳道，非入侵式给药，但生物利用度较低。

 

★中耳给药

 

鼓室注射（Intratympanic Injection）

 

操作步骤：

 

1.动物侧卧位固定，耳镜直视下穿刺鼓膜后上象限（避免损伤听小骨）。

 

2.微量注射器缓慢注入药物，留针一定时间防反流。

 

特点：鼓室给药经鼓膜穿刺，将药物直接注入中耳。鼓膜穿刺孔可自行愈合，对听力的影响较小。另一方面，鼓室注射药物在中耳停留时间短，药物易通过咽鼓管流失。该给药方式常用于急慢性中耳炎的局部药物递送。

 

★内耳给药

 

相比于外耳给药和鼓室注射，耳蜗内或者迷路内给药方法更能直接靶向内耳，可提高生物利用度，且可以精确控制治疗药物的用量。

 

1.圆窗膜给药（Round Window Membrane Delivery）

 

给药方法：

 

颞骨开窗，分离鼓室后壁软组织，暴露圆窗龛。

 

显微操作下将药物通过圆窗膜缓慢注射入耳蜗。

 

特点：药物直接经外淋巴液扩散至耳蜗，绕过血迷路屏障，生物利用度提高3-5倍，可减少系统的脱靶风险。适用于耳科基因治疗药物。

 

2.半规管给药

 

在实验动物中，通过半规管骨壁开窗，可以将药物直接递送至内耳的外淋巴液和内淋巴液。与圆窗注射相比，该给药方式具有较小的手术损伤，可较好的保留听力功能。

 

实验动物不同的耳局部给药方式。A，SD大鼠右耳鼓膜（图源：昭衍新药研究中心股份有限公司）。B，食蟹猴鼓室注射（图源：昭衍新药研究中心股份有限公司）C，食蟹猴内耳圆窗膜给药（图源：昭衍新药研究中心股份有限公司）。D，C57BL/6小鼠半规管给药（图源：昭衍新药研究中心股份有限公司）。E，小鼠圆窗膜给药（图片引自Lin, Y. C., et al., Frontiers in Pharmacology, 2020）。

 

听觉电生理检测

 

听觉电生理技术通过记录听觉通路中不同层级的生物电信号，能够定量、动态地评估药物对听觉系统的干预效果。该评估方法具有高灵敏度、实时性和非侵入性（或微创性）的特点，尤其适用于评估药物对耳蜗毛细胞、听神经及中枢听觉通路的特异性作用。

 

听觉电生理技术通过记录听觉通路中神经元电活动的时空特征，评估外耳至中枢神经系统的功能完整性。听觉传导路径如下：外耳（声波收集）→中耳（机械传导）→内耳耳蜗（毛细胞换能）→听神经（动作电位传递）→脑干（神经核团整合）→皮层（听觉感知）。

 

听觉传导通路

 

1.检测技术

 

听觉脑干反应（Auditory Brainstem Response，ABR）作为听觉通路的“全局监控”：通过头皮电极记录声音刺激诱发的脑干神经电活动，反映从听神经到脑干的听觉通路功能；如药物可能损伤听神经（如化疗药）或者中枢听觉处理系统（如具有神经毒性药物）时，进行ABR检测可以全面监控听觉传导通路。畸变产物耳声发射（Distortion Product Otoacoustic Emissions，DPOAE）作为耳蜗健康的“灵敏探针”：通过检测耳蜗外毛细胞对双音刺激产生的非线性畸变声信号，可反映耳蜗主动放大功能的健康状况；其能在耳毒性药物损伤作用前期，检测到外毛细胞功能异常，显著早于ABR或者组织学发现。进行药物非临床评价时将二者联合应用，可用于判断听觉损伤部位。例如若ABR异常而DPOAE正常，提示损伤位于耳蜗后（如听神经）；若两者均异常，则耳蜗为原发损伤靶点。

 

ABR：通过短声（click）或短纯音（tone burst）刺激，记录脑干神经核团的诱发电位，分析各波的潜伏期与振幅，评估听阈及神经通路完整性（如听神经瘤定位）。在常用试验动物中，啮齿类动物的听觉功能报导较多，学者们已经研究了十余种品系小鼠的听觉脑干反应，报导了常见动物BALB/cJ、C57BL/6J小鼠等的正常听觉阈值数据。

 

DPOAE：基于耳蜗外毛细胞非线性响应特性，检测2f1-f2畸变产物的声发射信号，定量评估耳蜗功能。耳蜗受一定频率比关系（f2/f1=1.2）的纯音f1、f2作用，两者相差20%。

 

辅助技术：耳蜗微音器电位（Cochlear Microphonic, CM）用于验证毛细胞活性；事件相关电位（Event-Related Potentials, ERP）解析高级听觉认知功能。

 

 

2.数据采集标准化流程

 

实验准备与动物管理

 

麻醉：使用合适的麻醉剂，维持麻醉深度以及呼吸频率稳定。

 

头部固定：使动物头部固定，确保耳道轴线与声刺激源对齐，避免耳道扭曲或鼓膜遮挡，防止声波传递失真。

 

信号采集

 

检测系统：TDT RZ6生物信号处理器。

 

电极定位和选择：选择合适的耳声发射探头并设置电极阻抗，以提高信噪比。阻抗过高可导致信号衰减，过低易引入噪声。

 

刺激类型：Click声（0.1ms脉宽）；短纯音（tone burst，上升/下降时间1ms，平台2ms）。

 

数据记录与质量控制

 

信号叠加：选择合适的信号叠加次数，以提升信噪比。

 

噪声控制：屏蔽室环境噪声＜30dB SPL。

 

3.数据分析

 

 ABR波形结果分析

 

听阈：听阈为引出ABR波形所需的最小声音强度，也是听力敏感性的客观测量指标。以SD大鼠click ABR结果为例，从高到低的音量刺激（90dB至35dB），波峰（波Ⅰ至波Ⅴ）振幅逐渐降低、峰时逐渐延后。在刺激强度为40dB的刺激音下，ABR波形无延续性，且无明显波峰；而在强度为45dB的刺激音下可观察到相对明显波峰Ⅱ，则该次检测听觉阈值可判定为45dB。

 

此外，除分析听觉阈值外，还可以分析以下指标：

 

潜伏期：声刺激开始与相应ABR峰值出现之间的时间间隔，提示了有关沿听觉通路的神经传导速度。

 

振幅：ABR峰值的大小，反映了听觉神经元同步放电的数量，提示听觉通路的完整性。

 

波形：ABR通常在刺激后的10ms内相继出现5到7个正向波，可以揭示有关听觉系统的功能组织和听力损失的类型。普遍认为，波I至波V分别与听觉神经、耳蜗核、上橄榄复合体、外侧丘系和下丘的神经元活动有关。以SD大鼠为例，可以明显观察到5个正向波，且波Ⅱ振幅最大，波Ⅲ振幅最小，与文献报道一致。

 

DPOAE数据分析

 

阈值判读：取DP值前后分别相邻两个值，共四个点并取平均值。当DP值减去平均值所得结果≥9，表示在该强度分贝下受检动物听力正常。在所有通过的DP值中，若所在的分贝值最小，则该分贝值为最小听觉阈值。

 

反应幅值：分析不同频率的反应幅值，对耳蜗功能进行评估。

 

不同实验动物听觉系统的组织病理学检查

 

在实验动物物种中，耳可分为三个区室。外耳包括耳郭和外耳道。鼓膜是外耳道和中耳之间的屏障。中耳由鼓膜形成的鼓室组成，内含锤骨、砧骨和镫骨三个听小骨。内耳由耳蜗（参与听觉）和前庭装置（平衡）组成。前庭器包括半规管、椭圆囊和小囊的骨迷路和膜迷路。椭圆囊和球囊是耳石器官。

 

根据给药方式的不同，对耳的组织病理学检查侧重点不同，如通过鼓膜中耳给药时，解剖摘取时要保证整个耳的完整，脱钙后取材时的方向要保证中耳腔的最大面，切片中要可见鼓膜、部分听小骨、以及内耳的corti器。如通过内耳圆窗给药时，解剖摘取时要保证不能破坏嵌入颞骨中的耳蜗，取材时要切到耳蜗的最大螺旋面。解剖时的精细摘取，固定和取材时的正确处理，以及制片中的重点关注是评价听觉系统的基础。

 

 

 

(昭衍新药视听平台/文 ) 

 

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