过程点微生物检测方法
1、目的
2、范围
适用于生产过程中的微生物检测。
3、工作程序
3.1 测试方法
采用膜过滤测试法（采用滤膜为0.45um）。
3.2培养基和试剂
3.2.1伊红美蓝琼脂培养基(用于测试过程点的大肠菌群)
称取37.5g伊红美蓝琼脂培养基溶于1L蒸馏水中,加热溶解，121℃15分钟高压灭菌。最好根据样品数量配制培养基，现配现用，一次性用完；若一次用不完，放在冰箱内保存，第二次再用时，需重新灭菌。
3.2.2乳糖胆盐培养基配制方法（检验样品中的大肠菌群）
称取35g乳糖胆盐培养基溶于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分别装于有倒立发酵管的试管中，115℃，15分钟，高压灭菌，现用现配，一次用完。
3.2.3平板计数琼脂(用于测试过程点的细菌总数)用电子称准确称取23.5g平板计数琼脂溶于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15分钟高压灭菌。最好根据样品数量配制培养基，现配现用，一次性用完；若一次用不完，放在冰箱内保存，第二次再用时，需重新灭菌。
3.2.4马铃薯葡萄糖琼脂(用于测试过程点的霉/酵母菌)
用电子称准确称取38g马铃薯葡萄糖琼脂溶于1L蒸馏水中, 加热煮沸至完全溶解、分装，121℃15分钟高压灭菌。最好根据样品数量配制培养基，现配现用，一次性用完；若一次用不完，放在冰箱内保存，第二次再用时，需重新灭菌。
3.2.5若培养基经过消毒后已凝固,使用之前需将装有培养基的瓶子放在微波炉进行溶解培养基灭菌后，应在无菌室超净工作台内采用火焰消毒操作法往每个培养皿中倒入16-18毫升培养基，培养基凝固后，将培养皿倒置放入冰箱备用。
3.3取样方法
3.3.1容器和管道冲洗水的取样方法：用无菌三角瓶取冲洗容器、管道后残留的新鲜水样500毫升。
3.3.2容器和管道内样品（调和液、炭滤后水、砂滤后水、储水罐原水等）的取样方法：
首先用75%的酒精棉认真擦拭取样口，然后用无菌三角瓶火焰下取样500毫升。
3.3.3压缩空气的取样方法：打开取样口快速放出适量气体，用酒精棉认真擦拭取样口，然后用火焰直接烧一下取样口至酒精全干，再调节气体流速（至不吹跑营养琼脂平板），打开事先准备好的营养琼脂培养平板的盖，暴露在离取样口10-15cm距离处的气流中，缓慢地旋转培养皿，暴露一分钟后盖上盖即可。
3.3.4室内空气的取样方法：用事先一天倒好的营养琼脂培养基平板，在室内空气不流动时，打开培养皿盖在空气中暴露30分钟，然后盖上盖即可。
3.3.5固体原材料的取样方法：用无菌钢勺，取适量样品，无菌操作下，装入一无菌瓶中，在无菌室加入300ml无菌水，摇匀后检测。
3.3.6容器内壁和设备表面的取样方法：首先用75%的酒精棉擦拭双手和取样用镊子，取适量湿无菌棉擦拭容器内壁或设备表面（6*6cm2），擦拭后迅速放入无菌瓶中，在无菌室加入300ml无菌水，摇匀后检测。
3.4做样
将膜过滤支架放在超净工作台上，确定其阀门处于关闭状态，用火焰对其上端进行灭菌，在取用已经灭菌的滤器（牛皮纸包裹121℃灭菌15分钟）之前，用酒精棉球擦拭双手，安装滤斗，将镊子在酒精灯火焰区灭菌，待凉后，开启无菌滤膜的外包装，用镊子夹取滤膜置于滤斗上，安装滤杯，注意刻度向外，夹上弹簧夹，取300毫升样品倒入滤杯，启动抽滤泵，马上开启阀门过滤，过滤完毕后，关闭抽滤泵，取下弹簧夹，拿下滤杯，用酒精棉球擦拭剪刀，与镊子一起在酒精灯火焰区灭菌，待凉后，用镊子夹住，用剪刀将滤膜均匀剪成三部分，取一小部分置于带有伊红美蓝琼脂培养基的培养皿中；取一部分置于带有平板计数琼脂的培养皿中；取一部分置于马铃薯葡萄糖琼脂的培养皿中。
3.5培养
将带有伊红美蓝琼脂培养基的培养皿，倒置于36℃～38℃恒温恒湿培养箱中，24±2小时后记录结果；将带有平板计数琼脂的培养皿，倒置于36℃～38℃恒温恒湿培养箱中，48±2小时后记录结果，将带有马铃薯葡萄糖琼脂的培养皿，倒置于25℃～28℃恒温恒湿培养箱中，72小时后开始观察，120小时后记录结果。
3.6报告
a.细菌平板：对滤膜上的菌落总数进行计数，以每100毫升所含菌落总数表示。
b.大肠菌群：对有可疑大肠菌群特征的菌落（紫红色中间带金属光泽的菌落）进行计数，并挑取此种菌落1～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖复发酵管，置于36℃～38℃恒温恒湿培养箱内，培养24±2小时，观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。或采用3M大肠菌群培养基快速培养。
c.霉/酵母菌平板：对滤膜上的菌落总数进行计数，以每100毫升所含菌落总数表示。
