水杨酸作为一种植物激素，具有抑菌作用，可治疗各种慢性皮肤病，广泛用于医药及护肤品中，但水杨酸在人体中会氧化为草酸，引起中毒，是一种食品禁用防腐剂。美国食品药品管理局、美国皮肤病学会认为水杨酸的安全限量为0.5%～2.0%。中国食品药品管理局也规定了护肤品中水杨酸的加入限量为2%。因此为了保证我国食品添加剂的安全性，测定食品添加剂中的水杨酸的含量具有重要的意义。

　　目前水杨酸的测定方法有光度法、荧光光谱法和液相色谱法等，但大多数主要是针对药品中水杨酸的检测。由于食品添加剂具有种类繁多、成分复杂、干扰物质大量存在等特点，在测定方法的选用上，考虑的重点是方法的选择性和稳定性。液相色谱法是报道最多的测定水杨酸的方法，该方法具有快速、灵敏、选择性好等优点；同时液相色谱仪是通用性仪器，也便于推广。本工作采用高效液相色谱法对食品添加剂中水杨酸进行了测定。

　　1试验部分

　　1.1仪器与试剂

　　Agilent1100高效液相色谱仪(包括二元泵，自动进样器，荧光检测器，柱温箱，Chemstation色谱工作站)。

　　水杨酸标准溶液：称取水杨酸标准品25.0mg，用乙腈溶解、定容至100mL容量瓶中，摇匀，配成0.250g·L-1标准储备溶液，冷藏保存；使用时用乙腈稀释配成10.0mg·L-1。

　　乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；试验用水为纯净水(经0.22μm滤膜过滤)。

　　1.2色谱条件

　　ZORBAXSB-C18色谱柱

　　(4.6mm×250nm，3.5μm)，柱温35℃；流动相：A为甲酸-乙腈(0.1＋99.9)溶液，B为甲酸-水(0.1＋99.9)溶液；梯度洗脱程序：0min时，A为20%；20min时，A为33%；22min时，A为90%；32min时，A为20%。流量1.0mL·min-1，进样量10μL；激发波长290nm，发射波长400nm。

　　1.3试验方法

　　称取食品添加剂样品1.0000g于100mL锥形瓶中(固体样品过0.2mm筛，液体、膏体样品直接称量)，加入含0.1%(体积分数，下同)甲酸的甲醇-水(9＋1)混合溶剂30mL，密封并称量。超声提取15min，并补足量，离心10min，经0.22μm滤膜过滤，滤液按色谱条件进行分析。

　　2结果与讨论

　　2.1检测器和检测波长的选择

　　考察了紫外(DAD)和荧光(FLD)检测器对水杨酸测定的影响。由水杨酸色谱峰的紫外和荧光光谱图可知：采用荧光检测器检测，选择性、干扰峰、基线稳定性、灵敏度均好于紫外检测器。对于种类繁多的食品添加剂样品，应选用荧光检测器检测水杨酸，确定荧光检测器发射波长为400nm，激发波长为290nm。

　　2.2色谱柱的选择

　　在色谱条件下，试验考察了SunfireTMC18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)、ZORBAXSB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，3.5μm)和AtlantisDC18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)的分离效果，结果表明：3种色谱柱的分离效果相当，但ZOR-BAXSB-C18色谱柱的半峰宽较其他两种色谱柱窄，试验选择ZORBAXSB-C18色谱柱(4.6mm×250nm，3.5μm)作为分析柱。

　　2.3流动相的选择

　　当用纯水和纯乙腈作流动相时，水杨酸的色谱峰严重拖尾。在流动相中加入少量的酸，可消除色谱峰的拖尾现象，当加入甲酸的量为流动相总体积的0.1%时，流动相的pH值和水杨酸的pKa值接近，试验选择甲酸-乙腈(0.1＋99.9)溶液、甲酸-水(0.1＋99.9)溶液为流动相。

　　2.4样品前处理条件的选择

　　提取水杨酸常用的提取溶剂有甲醇、无水乙醇、乙腈和酸性混合溶剂等。由于水杨酸邻位的羟基对羧基的影响比较复杂，彼此容易形成分子内氢键。这样将降低羧基中羟基氧原子上的电子云密度，有利于氢原子解离成质子。提取样品中水杨酸时，在溶剂中加入适量的酸不仅可以提高提取效率，而且可以降低水杨酸去质子化。加入甲酸、三氯乙酸、冰乙酸、磷酸进行试验，结果表明：采用含0.1%甲酸的甲醇-水(9＋1)混合溶剂作为萃取溶剂，萃取效果最好。并同固相萃取法进行了对比，结果显示：固相萃取前处理对样品液相色谱分析影响仅仅限于5min以前，对水杨酸色谱峰(12.27min)附近的杂质洗脱无显著作用。试验选择在测定食品添加剂中水杨酸含量时，不采用固相萃取前处理手段。

　　2.5工作曲线

　　移取适量水杨酸标准溶液于25mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，按色谱条件对水杨酸标准溶液系列进行测定，以水杨酸的质量浓度(μg·L-1)对其峰面积(A)进行回归，水杨酸的质量浓度在41.60～1664μg·L-1范围内与峰面积呈线性关系，线性回归方程为y＝0.0502＋0.7031ρ，相关系数为0.9997。检出限(3S／N)为1.55μg·L-1。

　　2.6精密度试验

　　按试验方法对香精样品溶液连续测定6次，测定值的相对标准偏差为1.08%。

　　2.7样品分析

　　按试验方法对30多个食品添加剂进行测定，结果表明：所测定的食品添加剂中均未检出水杨酸。在空白香精、香料样品中加入适量标准溶液，按试验方法处理样品并测定，回收试验结果见表1。

　　本工作采用高效液相色谱法测定食品添加剂中的禁用防腐剂水杨酸含量，方法操作简便、灵敏度高、且实用性较强，能够用于大多数食品添加剂的测定，对保证食品添加剂的安全性有重要的意义。