透射电子显微镜简介

眼睛是人类认识客观世界的第一架“光学仪器”，但它的能力却是有限的，通常认为人眼睛的分辨率为0.1 mm。17世纪初，光学显微镜出现，可以把细小的物体放大到千倍以上，分辨率比人眼睛提高了500 倍以上，这也是人类认识物质世界的一次巨大突破。20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)。现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍，而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵。

透射电镜，即透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称TEM），通常称作电子显微镜或电镜（EM），是使用最为广泛的一类电镜。透射电镜是一种高分辨率、高放大倍数的显微镜，是材料科学研究的重要手段，能提供极微细材料的组织结构、晶体结构和化学成分等方面的信息。透射电镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。

电子显微镜是一种高精密度的电子光学仪器，它具有较高分辨本领和放大倍数，是观察和研究物质微观结构的重要工具。电子显微镜是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示。

透射电子显微镜的应用

透射电镜具有分辨率高、可与能谱仪等其他技术联用的优点，在材料学、物理、化学和生物学等多个领域有着广泛地应用。材料的微观结构对材料的力学、光学、电学等物理化学性质起着决定性作用。透射电镜作为材料表征的重要手段，不仅可以用衍射模式来研究晶体的结构，还可以在成像模式下得到实空间的高分辨像，即对材料中的原子进行直接成像，直接观察材料的微观结构。电子显微技术对于新材料的发现也起到了巨大的推动作用，D.Shechtman 借助透射电镜发现了准晶，重新定义了晶体，丰富了材料学、晶体学、凝聚态物理学的内涵，D.Shechtman 也因此获得了2011年诺贝尔化学奖。

在物理学领域中，电子全息术能够同时提供电子波的振幅和相位信息，从而使这种先进的显微分析方法在磁场和电场分布等与相位密切相关的研究上得到广泛应用。目前，电子全息已经应用在测量半导体多层薄膜结构器件的电场分布、磁性材料内部的磁畴分布等方面。中国科学院物理研究所的张喆和朱涛等利用高分辨电子显微术和电子全息方法研究了Co 基磁性隧道结退火热处理前后的微观结构和相应势垒层结构的变化，研究结果表明，退火处理可以明显地改善势垒层和顶电极、底电极之间的界面质量，改进势垒本身的结构。

在化学领域，原位透射电镜因其超高的空间分辨率为原位观察气相、液相化学反应提供了一种重要的方法。利用原位透射电子显微镜进一步理解化学反应的机理和纳米材料的转变过程，以期望从化学反应的本质理解、调控和设计材料的合成。目前，原位电子显微技术已在材料合成、化学催化、能源应用和生命科学领域发挥着重要作用。透射电镜可以在极高的放大倍数下直接观察纳米颗粒的形貌和结构，是纳米材料最常用的表征手段之一。天津大学的杜希文和美国Brookhaven 国家实验室的Houlin L.xin 等用原位透射电镜观察了Co Ni双金属纳米粒子在氧化过程中形貌的变化，充分混合的Co、Ni 合金粒子经过氧化后，Co 和Ni 发生了空间上的部分分离，并在理论上对该现象进行了解释。

在生物学领域，X 射线晶体学技术和核磁共振常被用来研究生物大分子的结构，已经能够将蛋白质的位置精度确定到0.2 nm，但是其各有局限。X 射线晶体学技术基于蛋白质晶体，研究的常常是分子的基态结构，而对解析分子的激发态和过渡态无能为力。生物大分子在体内常常发生相互作用并形成复合物而发挥作用，这些复合物的结晶化非常困难。核磁共振虽然能够获得分子在溶液中的结构并且能够研究分子的动态变化，但主要适合用来研究分子量较小的生物大分子。近年来冷冻电镜技术突破了冷冻成像和图像处理瓶颈，发展成为当今结构生物学广泛应用的新兴技术。它可以以快速、高效、简易、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构，在很大程度上超越了传统的X 射线晶体学技术。清华大学施一公研究组利用酵母细胞内源性蛋白提取获得了性质良好的样品，利用单颗粒冷冻电子显微镜技术，解析了酵母剪接体近原子水平的高分辨率三维结构，阐述了剪接体对信使RNA前体执行剪接的工作机理。

透射电子显微镜的发展方向

目前，透射电子显微术有几个重要的发展方向。第一，分辨率的提升。分辨率一直是透射电镜发展的目标和方向，发展新一代单色器和球差校正器，进一步提高透射电镜的能量分辨率和空间分辨率，尤其是对低压电镜。第二，发展原位透射电镜技术。原位透射电镜在材料合成、化学催化、生命科学和能源材料领域有着重要应用，可以通过在原子尺度下实时观察和控制气相反应和液相反应的进行，从而研究反应的本质机理等科学问题。第三，更加广泛的应用在生物大分子结构研究中。冷冻电镜在生物大分子结构研究中的广泛应用，将推动冷冻电镜技术的不断发展。冷冻电镜在生物学领域的应用越来越受到重视，成为连接生物大分子和细胞的纽带和桥梁。

透射电子显微镜的制样流程

目前只有两种方法： 

一．负染色技术 

负染色技术简单快速，可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。尤其在病毒学中，负染色技术有着广泛的应用。 

样品要求：

①样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。

②样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。 

操作流程：吸取样品悬液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1～2min后滤纸吸去负染色液，待干后用于电镜观察。 

二、超薄切片技术 

超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下： 

1． 取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品）块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装20个以上的样品块，作为一个样送到平台。要求：

①取材前一定要和工作人员取得电话联系！

②取材选择部位要准确可靠，确保每块材料都是要观察的部位。

③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！

④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。

⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。

2． 漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。

3． 后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。 

4． 漂洗：用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次，每次15mins。 

5． 脱水：室温下，丙酮30％－50％－70％－80％－90％每级作用30mins，纯丙酮在作用3次，每次作用30mins。

6． 渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以二叶龄水稻叶片为例，其渗透流程如下：无水丙酮/包埋剂＝5：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝3：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：1作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：3作用12hours→无水丙酮/包埋剂＝1：5作用12hours→纯包埋剂作用45℃作用12hours。注意事项：包埋剂为强致癌剂，特别要注意规范操作！ 

7． 包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45℃聚合12hours，60℃聚合36～48hours。 

8． 超薄切片：超薄切片的切片面积最大不能超过0.5mm×0.3mm，比较难切的植物样品要求切片面积更小。超薄切片是在超薄切片机上进行，但是切出比较理想的超薄切片，却是一件不容易的工作。做好需要有渗透、包埋好的包埋块，还要有好的切刀以及操作者的熟练技术等。超薄切片前期需要准备载网和支持膜、修块、制刀等，前期准备工作至少需要半天时间。超薄切片是极其精细、耗费眼力的工作，需要静下心来慢慢操作，切好一个样品至少需要1小时。

9． 正染色：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐（如铅盐、铀盐等）与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。操作流程是：超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用醋酸铀染色30分钟，双蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。注意事项：

①醋酸铀具有放射性，使用时要特别注意。

②柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成不溶解的黑色颗粒，污染切片。柠檬酸铅染液一定要现用相配，所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。③由于染色不可控制因素较多，产生污染的几率有40％，所以每个样品的切片一定要留出铜网作备份。