HPLC-ICP-MS分析雄黄在大鼠脏器中代谢的砷形态

1 引言 
　　近年来，中药慢性中毒问题受到人们的高度重视。中药雄黄在我国传统医学中有着悠久的历史，具有解毒杀虫，燥湿祛痰，截疟等功效[1]。2010 年版《中国药典》[1]规定雄黄饮片中As2S2的含量应不低于90%，并对As2O3的量进行了限制。现代医学研究表明，雄黄在治疗白血病[2]、癌症[3]等恶性疾病方面也有不错的疗效。尽管雄黄具有这种独特的疗效，但由于其属于含砷矿物药，使其具有一定的毒性，而其毒性大小与砷的化学形态密切相关[4～6]。Rana等[7]报道了，砷暴露可通过干扰抗氧化防御系统和减小SOD2 的基因表达，从而对肝、肾造成损伤。 
　　目前，测定砷形态的分析方法主要有高效液相色谱与电感耦合等离子质谱联用技术（HPLC ICP MS）[8～10]、高效液相色谱与氢化物发生 原子荧光联用技术（HPLC HG AFS）[11，12]、高效液相色谱与氢化物发生 原子吸收联用技术（HPLC HG AAS）[13]、毛细管电泳与电感耦合等离子质谱联用技术（CE ICP MS）[14，15]、高效液相色谱与电喷雾离子质谱联用技术（HPLC ESI MS）[16]，主要用于食品等领域的测定，未见在雄黄代谢中应用的报道。 
　　本实验建立了HPLC ICP MS测定雄黄在大鼠肝肾中代谢砷形态的方法，为研究雄黄在大鼠体内的代谢提供支持，同时考察了样品前处理过程中砷形态之间的转化，并运用此法对雄黄在大鼠肝、肾中代谢后的砷形态进行了初步研究，为进一步研究雄黄的药代动力学提供合适的方法。 
 

　　2 实验部分 
　　2.1 仪器与试剂 
　　1200 型高效液相色谱仪及7500a 型电感耦合等离子体质谱仪（ICP MS，美国Agilent 公司）；Dionex IonPac AS19 阴离子交换柱（250 mm × 4 mm， 10 μm）；Milliplus 2150 超纯水处理系统（美国Millipore 公司）；数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）。 
　　（NH4）2CO3， NH3・H2O， H2O2（30%）、冰醋酸、NaCl均为优级纯；砷标准物质：亚砷酸根离子＼[As]、 砷酸根离子＼[As]、一甲基砷（MMA）、二甲基砷（DMA）、砷甜菜碱（AsB），均购于中国计量科学研究院。超纯水（电阻率18.2 MΩ・cm）。 
　　2.2 质谱与色谱条件 
　　ICP MS 条件：RF入射功率1450 W，载气为高纯氩气，载气流速0.65 L/min，辅助气流速0.45 L/min， 射频电压1.72 V，采样深度7.8 mm，泵速0.3 r/s，检测同位素 75As和35Cl。 
　　HPLC 条件：Dionex IonPac AS 19 阴离子分析柱；流动相： 20 mmol/L （NH4）2CO3 （pH=9.7）；流速：1.2 mL/min；柱温为室温；进样体积：25 μL。 
　　2.3 染毒方法 
　　取4周龄Wistar大鼠4只，体重（50 ± 10）g。分为低、中、高剂量组，给药剂量分别为0.3， 0.9和2.7 g/kg （以0.5% CMC 为混悬介质），对照组给予0.5 % CMC （羧甲基纤维素钠），雄黄染毒组灌胃给药，每天灌胃1 次，连续6星期。染毒期间每3 天称重1 次，调节灌胃剂量。实验动物室温度（24±1） ℃， 相对湿度（50±5）%，每天12 h光照，动物可自由摄食摄水。于末次给药2 h后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，取肝脏和肾脏。 
　　2.4 样品前处理方法 
　　称取0.3～0.4 g （精确到0.001 g）粉碎后的试样，加38 mL 水、2 mL 3%乙酸溶液，涡旋混匀后，60 ℃ 水浴超声2 h， 于4 ℃ 冰箱中静置5 min后，取出，于4 ℃以9000 r/min离心10 min，上清液过0.2 μm滤膜。同时制备各试剂空白溶液。 
 

　　3 结果与讨论 
　　3.1 色谱条件的优化 
　　阴离子交换色谱和阳离子交换色谱均可用于砷形态分析。根据砷化合物的离子特性，阴离子交换色谱通常用来分析As、As、MMA 和 DMA，而阳离子交换色谱用于分离AsB、AsC、TMAO 和TETRA。 
　　在阴离子交换色谱中，AsB 和As在中性pH 条件下于死体积处共洗脱。通过向流动相中加入酒石酸后，使As与酒石酸形成阴离子的络合物，在色谱柱内产生较强的保留特性，从而使As与AsB 分开[17]。也可通过增大pH值至9.0 以上[18]或将As氧化成As实现与AsB 的分离。 
　　本实验采用Dionex IonPac AS 19阴离子色谱柱，以20 mmol/L （NH4）2CO3 作流动相，对流动相的pH 值和流速进行了优化。