酶联免疫结合法中，马铃薯的预处理很简单，只需将马铃薯组织捣碎均匀并稀释即可。同时，该方法具有敏感性、特异性的特点，并且有一个很好的终点判断;且该方法不需要昂贵的仪器。但缺点是获得抗原和抗体所经历的时间较长，同时实验的操作时间也比较长。

 

四、马铃薯中龙葵碱提取及测定：

龙葵碱不溶于水、乙醚和石油醚，可溶于甲醇、乙醇、戊醇、丙酮等。对碱较稳定，pH 大于8 时沉淀。经稀酸水解后，可生成茄健和相应的糖(包括葡萄糖、鼠李糖和半乳糖)。在稀硫酸性环境下，与酸反应生成茄咙。茄咙在酸性环境中与甲醛溶液作用生成橙红色化合物，在一定范围内，颜色的深浅与茄咙含量成正比。可用分光光度计在520nm 处测定。

根据所用的有机溶剂种类和数量的不同，现有的主要方法可分为单溶剂法，双溶剂法和混合溶剂法等。混合溶剂法所需试剂较贵，同时试验过程中需要昂贵的仪器，使成本过高。双溶剂法的乙醇一乙酸法和单溶剂法的甲醇法都有一定的优缺点，乙醇一乙酸法需要的时间比较长，而甲醇法使用的甲醇有毒，且准确度偏低。本试验利用单溶剂乙醇替代甲醇，结合乙醇一乙酸法的试验流程并改进，比较研究了乙醇法与乙醇一乙酸法提取马铃薯中龙葵碱的效果。

 

1. 材料与方法

 

1.1 试验材料

马铃薯:取适量马铃薯，发芽处理。洗净，组织捣碎机捣碎，混匀。60℃烘干，植物样品粉碎机粉碎，备用龙葵碱标准品:a一茄碱，购于sigma公司，纯度)99.8%

 

1.2 仪器与试剂

95%乙醇: AR，GB679 一94

1%硫酸:量取5.65ml 浓硫酸，缓缓注入冷水中，于I000ml容量瓶中定容，摇匀

1%甲醛: 量取25ml 的甲醛，加入冷水中，于1000ml 容量瓶中定容，摇匀

浓氨水: AR，GB631 一89

1%氦水: 量取45.5ml的浓氨水，加入冷水中，于1000ml容量瓶中定容，摇匀

浓硫酸: AR

冰乙酸: AR，GB676 一90

仪器：磁力搅拌器、水浴锅、索氏脂肪提取器、贝克曼分光光度计、圆底烧瓶、直形冷凝管、电子天平(2009，0.lmg)、组织捣碎机、植物样品微粒粉碎机。

 

2.提取分离方法

乙醇法:称取209 的马铃薯鲜样品，将样品和几个玻璃珠(防止加热沸腾)放置于250ml的圆底烧瓶中，添加100ml的95%乙醇，将圆形烧瓶连接直形冷凝管，放置于水浴锅，调节温度为85 一95℃，水浴4 个小时。冷却，过滤取滤液，回收乙醇近干，然后将剩余的乙醇倒入蒸发皿中，将乙醇蒸干。用30ml 的5%硫酸溶解剩余物，过滤，收取滤液，加入浓氨水调节PH 值为10 一10.5，冷却，放置于冰箱过夜。

4℃，5000r/min 离心，去上清液，用l%氨水洗涤，再离心，洗涤，至洗涤液澄清，离心，取沉淀即得粗样品。

乙醇一乙酸法:称取2 鲍的烘干马铃薯鲜样品，加100ml 乙醇和3ml 乙酸，磁力搅拌器搅拌15 分钟，过滤。滤液装入索氏脂肪抽提器的称脂瓶，滤渣用滤纸包住，放入索氏脂肪提取器的滤纸筒内，水浴抽提16 小时后，回收乙醇近干，然后将剩余的乙醇倒入蒸发皿中，将乙醇蒸干。用30ml 的5%硫酸溶解剩余物，过滤，收取滤液，加入浓氨水调节pH值为10~10.5，冷却，放置于冰箱过夜。4℃，5000r/min离心，去上清液，用1%氨水洗涤，再离心，洗涤，至洗涤液澄清，离心，取沉淀即得粗样品。

3.测定方法

龙葵碱标准溶液:精确称取0.0500g 龙葵碱，加入l%硫酸溶液溶解，移入50ml容量瓶中，加入1%硫酸溶液至刻度，摇匀。此溶液每ml 含龙葵碱lmg。标准曲线的制作:取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准溶液以1%硫酸稀释到2ml，置冰浴中逐渐加入5ml硫酸(宜于3分钟以上时间滴完)，放置1分钟，然后置冰浴中滴加2.5mll%甲醛(在2 分钟以上时间滴完)，放置90 分钟后，于520nm 波长测定吸光度。

样品的测定:将提取的粗样品用l%硫酸溶解，定容到10ml。取2ml 的样品溶液，与标准曲线的制备同样操作，先预测其大概浓度，再以1%硫酸调节样品浓度，使之每毫升在0.2mg 以下，取2ml按标准曲线制备项下操作，于520nm 波长测定吸光度，计算含量。

 

4.马铃薯中龙葵碱含量的计算公式

X（mg/100g）=（P*V*50）/m

式中X—100g样品中所含龙葵碱的量

P—测定结果相应的标准浓度（mg/ml）

V 一样品提取之后定容总体积(ml)

m 一样品量(g)

谱图示例