总植物碱检测实验

马铃薯毒素

简介

一、龙葵碱的简介及性质：龙葵碱又名茄碱、龙葵毒素、马铃薯毒素，是由葡萄糖残基和茄啶组成的一种弱碱性糖苷。不溶于水、乙醚、氯仿，能溶于乙醇，与稀酸共热生成茄啶(CHNO)及一些糖类。茄啶能溶于苯和氯仿。存在及毒性：龙葵碱广泛存在于马铃薯、番茄及茄子等茄科植物中。在番茄青绿色未成熟时，里面含有...查看详情>>

马铃薯毒素

简介

一、龙葵碱的简介及性质：

龙葵碱又名茄碱、龙葵毒素、马铃薯毒素，是由葡萄糖残基和茄啶组成的一种弱碱性糖苷。不溶于水、乙醚、氯仿，能溶于乙醇，与稀酸共热生成茄啶(CHNO)及一些糖类。茄啶能溶于苯和氯仿。

存在及毒性：龙葵碱广泛存在于马铃薯、番茄及茄子等茄科植物中。在番茄青绿色未成熟时，里面含有龙葵碱。马铃薯中龙葵碱的含量随品种和季节的不同而有所不同，一般为0.005%～0.01%，在贮藏过程中含量逐渐增加，马铃薯发芽后，其幼芽和芽眼部分的龙葵碱含量高达0.3%～0.5%。龙葵碱口服毒性较低，对动物经口的LD50 为：绵羊500mg/kg 体重，小鼠1000mg/kg 体重，兔子450mg/kg 体重。人食入0.2～0.4g龙葵碱即可引起中毒。龙葵碱并不是影响发芽马铃薯安全性的唯一因素，引起中毒可能是与其他成分共同作用的结果，其毒理学作用机理还需要进一步研究。

二、龙葵碱的提取方法

1.单溶剂法

单溶剂法就是用一种溶剂来提取龙葵碱，采用的溶剂有甲醇或1%乙酸。Jellma等〔1981)详细地描述了甲醇法。该试验用甲醇萃取，把甲醇挥发掉后用乙酸溶解，然后调PH>9，水浴，静置，沉淀:沉淀用冷氨水冲洗，加甲醇溶解，离心，取上清液，旋转蒸发至干(防止烧焦)，即可得样品。单溶剂使用的甲醇有毒，且甲醇没有挥发完全，使龙葵碱的提取不完全，回收率较低。用乙酸提取时，淀粉难于除掉，要利用乙醇去除淀粉，使实验过程过多，误笙增人。

2.双溶剂法

双溶剂法就是用两种溶剂来提取龙葵碱，采用的溶剂有甲醇和氯仿、96%的乙酸与1%乙酸以及1 一庚烷磺酸和乙酸。Fitzpatrick 等(1974)详细地报道了甲醇和氯仿的方法。样品中加提取液抽滤，滤液加Na2SO4，放置于分液漏斗中分层。取甲醇层，旋转蒸发甲醇，浓缩液加H2SO4;水浴回流，用碱调节pH，苯萃取，旋转蒸发苯至干，即可得样品。该方法使用Na2SO4 分层效果欠佳，弃去的氯仿层中仍含有一定数量的甲醇，而甲醇中含有龙葵素，使结果偏低;另外，该法使用硫酸高温回流时，使龙葵素水解，限制了其准确的定量检测法。

Haddadin 等(2001)与宁正详等(1998)采用的混合溶剂是乙酸与乙酸。该方法利用酸性环境下，乙醇溶解龙葵碱，然后挥发掉乙醇，用碱处理，得到龙葵素粗样品。

该方法操作过程中，由于有脂肪提出，使酸溶解龙葵碱不完全，造成结果偏小。

3．混合溶剂法

混合溶剂法就是利用三种以上溶剂来提取龙葵碱，采用的溶剂系统有水一冰乙酸一亚硫酸钠或四氢吠喃一水一乙睛一冰乙酸等。Bushway等(1985)采用的是四氢吠喃一水一乙睛一冰乙酸方法。样品加混合提取液，G1 漏斗抽滤，将滤液旋转蒸发至5ml左右。浓缩液加2ml 冰乙酸，然后用提取液将其转移至离心管中，超声波处理后，离心。取上清液，加浓氨水，水浴，静置，离心，沉淀即是粗样品。混合溶剂的方法回收率较高，但溶剂较贵，并且需使用昂贵的仪器，使成本过高。

三、龙葵碱的测定方法

马铃薯中龙葵碱的测定方法已经有很多报道，采用的方法主要有比色法，高效液相色谱法，酶联免疫法，薄层层析，气相色谱法和显色滴定法。

1. 比色法

比色法的仪器是分光光度计，利用龙葵碱酸解后，在浓硫酸环境下与甲醛显色反应的性质，通过测定吸光度确定含量。Haddadin 等(2001)将样品用乙醇和硫酸溶解，然后加硫酸静置，添加0.5%甲醛。静置3 小时后比色。宁正详等(1998)是将样品用硫酸溶解，取出2ml，于冰浴中添加5ml 浓硫酸，其时间不能少于3 分钟，静置1分钟后，添加的l%甲醛溶液，静置90 分钟后，于分光光度计520nm 处比色，测出其吸光度，对照标准曲线，求出其含量。比色法的优点就是所需的仪器很简单，具有很好的操作性，同时所需的时间也不是很长，其缺点就是精确度没有其余的方法

高。

2．高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法:根据龙葵碱在流动相中的吸附性不同，所通过的速度不同，峰的出现时间也不同。国外目前的研究大部分都是采用此方法，如Bushway等(1986)、Carman 等(1986)。Friedman 等(1992)采用高效液相色谱法确定龙葵碱的含量。实验中采用的是Beekman334 液相色谱(其柱子为C.，Perkin 一Elmer)。流动相为50%乙睛层含有十二烷基磺酸钠，加5ml 硫酸钠，其PH 用1%硫酸调节为4.5。通过速度为lml/min，检测波长为200nm。

高效液相色谱法的优点是如果各种条件都满足的话，重复性好，回收率也很高，其中a 一茄碱可达93%士1.3，而a 一卡茄碱可达99%士3.1。其缺点是受很多种因素影响，如柱、溶剂的不同都影响其准确度。另外，色谱的流动相对实验的结果也有影响，而且一该方法所使用的仪器很昂贵，限于实验室中研究时使用。

3.酶联免疫结合法

酶联免疫结合法的原理是酶标记抗原或抗体，再利用免疫反应去测定抗原或抗体，其浓度可用酶活力的大小反映出来。Michael 等(1983)采用酶联免疫结合法测定龙葵碱的含量，利用龙葵碱一牛血清蛋白作为抗原有特定的抗血清反应。试验的抗原是通过高碘酸盐裂解法合成的。将样品或标准品以及龙葵碱一牛血清蛋白加入洞内，加入免疫抗体，然后于35℃保温3 小时，加入缓冲液后，4 记录最佳的浓度。龙葵素的浓度通过标准曲线求得。

酶联免疫结合法中，马铃薯的预处理很简单，只需将马铃薯组织捣碎均匀并稀释即可。同时，该方法具有敏感性、特异性的特点，并且有一个很好的终点判断;且该方法不需要昂贵的仪器。但缺点是获得抗原和抗体所经历的时间较长，同时实验的操作时间也比较长。

四、马铃薯中龙葵碱提取及测定：

龙葵碱不溶于水、乙醚和石油醚，可溶于甲醇、乙醇、戊醇、丙酮等。对碱较稳定，pH 大于8 时沉淀。经稀酸水解后，可生成茄健和相应的糖(包括葡萄糖、鼠李糖和半乳糖)。在稀硫酸性环境下，与酸反应生成茄咙。茄咙在酸性环境中与甲醛溶液作用生成橙红色化合物，在一定范围内，颜色的深浅与茄咙含量成正比。可用分光光度计在520nm 处测定。

根据所用的有机溶剂种类和数量的不同，现有的主要方法可分为单溶剂法，双溶剂法和混合溶剂法等。混合溶剂法所需试剂较贵，同时试验过程中需要昂贵的仪器，使成本过高。双溶剂法的乙醇一乙酸法和单溶剂法的甲醇法都有一定的优缺点，乙醇一乙酸法需要的时间比较长，而甲醇法使用的甲醇有毒，且准确度偏低。本试验利用单溶剂乙醇替代甲醇，结合乙醇一乙酸法的试验流程并改进，比较研究了乙醇法与乙醇一乙酸法提取马铃薯中龙葵碱的效果。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

马铃薯:取适量马铃薯，发芽处理。洗净，组织捣碎机捣碎，混匀。60℃烘干，植物样品粉碎机粉碎，备用龙葵碱标准品:a一茄碱，购于sigma公司，纯度)99.8%

1.2 仪器与试剂

95%乙醇: AR，GB679 一94

1%硫酸:量取5.65ml 浓硫酸，缓缓注入冷水中，于I000ml容量瓶中定容，摇匀

1%甲醛: 量取25ml 的甲醛，加入冷水中，于1000ml 容量瓶中定容，摇匀

浓氨水: AR，GB631 一89

1%氦水: 量取45.5ml的浓氨水，加入冷水中，于1000ml容量瓶中定容，摇匀

浓硫酸: AR

冰乙酸: AR，GB676 一90

仪器：磁力搅拌器、水浴锅、索氏脂肪提取器、贝克曼分光光度计、圆底烧瓶、直形冷凝管、电子天平(2009，0.lmg)、组织捣碎机、植物样品微粒粉碎机。

2.提取分离方法

乙醇法:称取209 的马铃薯鲜样品，将样品和几个玻璃珠(防止加热沸腾)放置于250ml的圆底烧瓶中，添加100ml的95%乙醇，将圆形烧瓶连接直形冷凝管，放置于水浴锅，调节温度为85 一95℃，水浴4 个小时。冷却，过滤取滤液，回收乙醇近干，然后将剩余的乙醇倒入蒸发皿中，将乙醇蒸干。用30ml 的5%硫酸溶解剩余物，过滤，收取滤液，加入浓氨水调节PH 值为10 一10.5，冷却，放置于冰箱过夜。

4℃，5000r/min 离心，去上清液，用l%氨水洗涤，再离心，洗涤，至洗涤液澄清，离心，取沉淀即得粗样品。

乙醇一乙酸法:称取2 鲍的烘干马铃薯鲜样品，加100ml 乙醇和3ml 乙酸，磁力搅拌器搅拌15 分钟，过滤。滤液装入索氏脂肪抽提器的称脂瓶，滤渣用滤纸包住，放入索氏脂肪提取器的滤纸筒内，水浴抽提16 小时后，回收乙醇近干，然后将剩余的乙醇倒入蒸发皿中，将乙醇蒸干。用30ml 的5%硫酸溶解剩余物，过滤，收取滤液，加入浓氨水调节pH值为10~10.5，冷却，放置于冰箱过夜。4℃，5000r/min离心，去上清液，用1%氨水洗涤，再离心，洗涤，至洗涤液澄清，离心，取沉淀即得粗样品。

3.测定方法

龙葵碱标准溶液:精确称取0.0500g 龙葵碱，加入l%硫酸溶液溶解，移入50ml容量瓶中，加入1%硫酸溶液至刻度，摇匀。此溶液每ml 含龙葵碱lmg。标准曲线的制作:取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准溶液以1%硫酸稀释到2ml，置冰浴中逐渐加入5ml硫酸(宜于3分钟以上时间滴完)，放置1分钟，然后置冰浴中滴加2.5mll%甲醛(在2 分钟以上时间滴完)，放置90 分钟后，于520nm 波长测定吸光度。

样品的测定:将提取的粗样品用l%硫酸溶解，定容到10ml。取2ml 的样品溶液，与标准曲线的制备同样操作，先预测其大概浓度，再以1%硫酸调节样品浓度，使之每毫升在0.2mg 以下，取2ml按标准曲线制备项下操作，于520nm 波长测定吸光度，计算含量。

4.马铃薯中龙葵碱含量的计算公式

X（mg/100g）=（P*V*50）/m

式中X—100g样品中所含龙葵碱的量

P—测定结果相应的标准浓度（mg/ml）

V 一样品提取之后定容总体积(ml)

m 一样品量(g)

马铃薯中龙葵碱的测定方法