药物中硫酸二烷基酯类基因毒杂质的检测方法_检测资讯

药物中硫酸二烷基酯类基因毒杂质的检测方法

嘉峪检测网 2020-05-13 11:12

概述

硫酸二烷基酯类化合物（结构见图1）是医药行业中常见的烷基化试剂，例如硫酸二甲酯（DMS）常被应用于药物合成过程中的O-甲基化、S-甲基化、N-甲基化、芳香甲基化、胺转化等反应，典型案例有多巴胺受体激动剂罗替戈汀的第一步合成中，2,3-二羟基萘被硫酸二甲酯O-甲基化形成甲基醚；用于高血压治疗的血管紧张素II受体拮抗剂替米沙坦合成时，使用硫酸二甲酯将邻硝基苯胺甲基化；非甾体抗炎药罗非昔布合成工艺中，在氢氧化钠存在下用硫酸二甲酯处理1-（4-巯基苯基）乙酮以形成4-甲硫基苯乙酮。硫酸二烷基酯类化合物也常常在药品生产工艺中作为反应副产物出现，例如调血脂的药物依折麦布的合成过程中用到硫酸和异丙醇，两者易发生反应生成硫酸二异丙酯；氟喹诺酮类广谱抗菌剂恩诺沙星合成工艺中存在的浓硫酸和甲醇经化学反应有可能形成硫酸二甲酯；治疗骨关节炎和风湿性关节炎药物塞来昔布以三氟乙酸和乙醇为起始原料，在浓硫酸及高温条件下反应时具有生成硫酸二乙酯的可能性，因此需要对其进行严格控制。

药物中硫酸二烷基酯类基因毒杂质的检测方法

图1.硫酸二烷基酯类化合物结构图

硫酸二烷基酯类化合物是已知的具有致癌致畸作用的试剂，其可通过对核酸盐烷基化并引起遗传性基因损害和染色体突变，欧盟在2012年12月将硫酸二甲酯（DMS）和硫酸二乙酯（DES）列入第八批需授权物质（SVHC）候选清单，国际癌症研究中心（IARC）也已经将硫酸二甲酯列为2A类致癌物。因此，建立快速、灵敏、准确、可靠的硫酸二烷基酯类化合物分析方法，从而严格控制药物和医药中间体中硫酸二烷基酯类化合物的含量是非常必要的。

根据参考各国药典及文献，总结了部分含有硫酸二烷基酯类基因毒杂质药物的种类，详见表1。

药物中硫酸二烷基酯类基因毒杂质的检测方法

表1. 含有硫酸二烷基酯类基因毒杂质药物列表

常用的检测方法

直接检测法：

目前硫酸二烷基酯类化合物检测方法较多，大多采用常规检测方法，如离子色谱法（IC）、气相色谱法（GC）、顶空气相色谱法（HS-GC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）等。其中，气相色谱法又分为气相色谱火焰光度法（GC-FPD）和气相色谱氢火焰离子化法（GC-FID）等。有文献报道，采用GC法配置氢火焰离子化检测器（FID），以氮气为载气，直接测定依折麦布原料药中硫酸二异丙酯杂质的残留；采用GC-MS的方法，在选择离子检测扫描模式（SIM）下采集，直接测定恩诺沙星中基因毒性杂质硫酸二甲酯的含量；也有文献显示，建立LC-MS/MS法，在电喷雾离子化（ESI），负离子模式下MRM 采集，测定药物左舒必利及起始原料中硫酸二甲酯的残留量。值得注意的是，文献报道的DMS大多采用GC或GC-MS法测定，但是DMS稳定性较差，气化温度较高时，DMS会部分分解为甲醇，色谱图中出现两个峰，因此采用气相方法时温度需严格控制，避免影响方法的准确度和精密度。

衍生化法：

由于硫酸二烷基酯类化合物的气相检测方法在某些条件方面要求较为严格，为了满足分析方法的要求，也为了提高硫酸二烷基酯类化合物的检测灵敏度，可以选择柱前衍生的方法进行检测。比如国标法用对硝基苯酚作衍生试剂，将DMS衍生化成对硝基茴香醚，再用紫外检测器检测；也有文献报道将DMS衍生化成N-甲基吡啶，质谱检测器正离子模式检测，或者衍生成N-甲基苯胺，火焰离子化器（FID）直接进样检测。药物中硫酸二烷基酯类基因毒性杂质衍生化法检测的实际应用也很常见，比如衍生后顶空气相法测定塞来昔布中硫酸二乙酯的残留，该法采用碘化钠作为衍生化试剂，将DES衍生成碘甲烷后顶空进样，电子捕获检测器测定其含量。

案例

塞来昔布：

塞来昔布（Celecoxib，化合物1，图2），化学名为4-［5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基］苯磺酰胺，为特异性的COX-2 抑制剂，临床上主要用于治疗骨关节炎和风湿性关节炎。塞来昔布的合成工艺中以三氟乙酸和乙醇为起始原料在浓硫酸及高温条件下反应，生成三氟乙酸乙酯，再进一步反应生成塞来昔布关键中间体和终产品。乙醇在浓硫酸和高温条件下，具有潜在生成基因毒性杂质硫酸二乙酯的可能性，因此应严格控制其在塞来昔布及中间体中的限量。根据ICH，对于长期服用的药物基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg/d，塞来昔布的最大日剂用量为600 mg，则对应的基因毒性杂质DES的限度为5 ppm。

药物中硫酸二烷基酯类基因毒杂质的检测方法

图2. 塞来昔布的合成工艺

因此，采用衍生后顶空进样气相色谱，电子捕获检测器测定塞来昔布中DES的含量。根据ICH指南的要求，对该方法进行了检测限（LOD）、定量限（LOQ）、线性、精密度、准确性等相关验证，DES在40~200ng/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数R2 = 0.9996，DES的LOD和LOQ分别能够达到20 ng/mL及40 ng/mL ，平均回收率为90.37 %，RSD为5.38 %。本法灵敏、可靠、简单且无机制干扰，适合在痕量水平下对塞来昔布中DES进行控制，为塞来昔布工艺过程控制和质量保障提供参考依据。

美托洛尔:

美托洛尔（Metoprolol，化合物4，图3），化学名为(±)-1-异丙氨基-3-[对-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇，为β受体拮抗剂，临床用于治疗各型高血压(可与利尿药和血管扩张剂合用)及心绞痛。美托洛尔的合成以对甲氧基乙基苯酚为起始原料，在氢氧化钠作用下与环氧氯丙烷取代生成中间体5，再在异丙醇中与异丙胺开环加成得到1-异丙氨基-3-[对-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇，即美托洛尔。起始物料对甲氧基乙基苯酚的合成工艺中用到硫酸二甲酯作为甲基化试剂，硫酸二甲酯已被国际癌症研究中心列为2A类致癌物，属于已知致癌性的基因毒性杂质，需要严格控制其在美托洛尔及其起始物料中的残留量。

药物中硫酸二烷基酯类基因毒杂质的检测方法

图3. 美托洛尔合成工艺

因此，采用衍生后LC-MS或LC-MS/MS的方法测定对甲氧基乙基苯酚及美托洛尔中DMS的含量，即以吡啶为衍生化试剂，在乙腈溶液中将DMS衍生处理后经HILIC分离和（+）ESI / MS（SIM）检测。在该方法下，DMS的LOQ为0.06 μg/mL，在0.05~10 μg/mL的范围内成良好的线性关系，相关系数R2 = 0.9965，回收率范围101.0~113.8%。该方法快速、简单、准确且经全面验证后符合检测的需求。

总结

硫酸二烷基酯类化合物常被用作烷基化试剂或者反应副产物存在于药物合成过程中，这些物质可能会残留于终产品中成为杂质，对人体器官如眼、上呼吸道产生强烈刺激作用，并损害肝、肾组织和心肌等，更因其致癌性和致畸变性导致癌症和遗传性基因损害的发生。因此，药品中如果含有硫酸二烷基酯类化合物残留，药品就会存在质量缺陷并对人类健康造成威胁，建立快速、灵敏、准确、可靠的分析方法以控制药物中硫酸二烷基酯类化合物的含量在人类医药领域发展进程中显得尤为重要。

基因毒性杂质最主要的特点是在极低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，导致基因突变并促使肿瘤发生。因其毒性很强，对药物的安全性造成强烈的威胁，行业中已多次出现由于基因毒性杂质控制不合规，造成上市药品强行被召回的案例，给企业造成了巨大的损失。因此，在个体对自身健康更为重视，审查机构对药品质量合规性核查更为严格的今天，如何更好的运用QbD理念以控制药品中基因毒性杂质的含量并最大程度的降低成本，已成为当今企业的必修课之一。

本文根据以下文章进行编辑整理，仅用于学习、交流：.

1. Nelu Grinberg，Florin Albu，Keith Fandrick，Elena Iorgulescu，Andrei Medvedovici, Assay at low ppm level of dimethylsulfate in starting materials for API synthesis using derivatization in ionicliquid media and LC–MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2013), 75, 1-6.

2. 汪生，倪悦泠，陆宇婷，宋敏，杭太俊，顶空气相色谱法测定塞来昔布中硫酸二乙酯基因毒性杂质，Chinese Journal of New Drugs (2018), 27 (20), 2437-2441.

3. 张耕，许兵，梅勇，柱前衍生气相色谱法测定工作场所空气中的硫酸二甲酯，Modern Preventive Medicine (2018), 45 (12) , 2137-2140.

4.Jianguo An，Mingjiang Sun，Lin Bai，Ted Chen，David Q. Liu，Alireza Kord，A practical derivatization LC/MS approach fordetermination of trace level alkyl sulfonates and dialkyl sulfates genotoxicimpurities in drug substances, Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis (2008), 48, 1006–1010.

来源：诺衡分析

药物中硫酸二烷基酯类基因毒杂质的检测方法

相关新闻：