前言

检测限和定量限是分析方法的重要属性，在中国药典2020年版分析方法验证指导原则^[1]中规定这2项是重要的验证指标，包括定量、限度的杂质测定需要着重考虑检测限和定量限，且在该版本指导原则中删除了校正因子以及其中定量限的规定。本文试图从定义、测量方法、常见问题和解决方案进行简单的讨论，为分析方法验证活动中检测限和定量限的的开展提供一定的参考。 

1、检测限和定量限的定义

检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量，定量限系指试样中被测物能被定量测定的最低量。检测限仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。而对微量或痕量药物分析、定量测定药物杂质和降解产物时，应确定方法的定量限，需要注意的是定量限的测定结果应符合准确度和精密度要求。 

2、检测限和定量限的测量方法

检测限和定量限常用的测量方法有直观法、信噪比法、基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法等3种方法，不同方法应用范围有所不同^[2]：

（1）直观法主要用于非仪器方法，通过目视法观察逐级稀释进样获得非仪器方法检出限（或定量测定）的最低浓度或量。

（2）信噪比法适用于能显示基线噪音的仪器分析方法，是通过已知低浓度的被测物的检测信号与基线噪音比较，确定可被检测出的最小量或浓度。检测限一般以信噪比为3:1或2:1；定量限一般以信噪比为10:1。

（3）基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法可采用已知标准物质与空白样品，或已知含量的样品在低浓度范围按照分析步骤进行测量，通过分析相当数量的样品（需要12~20份）计算方法的检出限和定量测定最低浓度或量，其计算公式为（公式1）：

LOD（LOQ）=3.3（或10）δ/S  

式中：LOD（LOQ）：检测限（定量限）；δ：响应值的偏差；S：标准曲线的斜率。δ可以通过下列方法测得：（1）测定空白值的标准偏差；（2）标准曲线的剩余标准偏差或是截距的标准偏差来代替。

当已知含量标准物质为单点时，检出限公式也可以表达如下（定量限D_L公式相同，置信因子取10，公式2）：

3、检测限和定量限的常见问题

由于使用上的方便性，信噪比法是目前方法验证中最常用的测量方法。但信噪比受检测仪器状态的影响很大，且与耗材、试剂、样品前处理等多种因素相关，按信噪比3/10计算与验证过的检测限/定量限在下一次检测时并不是方法的检测限/定量限，因此导致方法验证出现异常，测量的定量限（检测限）并不是真正的方法定量限，特别是定量限可能不能满足精密度和准确度要求，即定量限测不准原理^[3]。

信噪比法测量检测限和定量限的主要问题在于其本质上也是一种直观测量的方法，主要用于仪器检出限的测量和判断。而仪器检出限（对于复杂的系统更应该称为系统检出限）则受到由整个检测系统性能的影响（如高效液相法由HPLC仪器、色谱柱、流动相、检测器共同组成），其是一个动态的结果。当一台经确认的仪器（完成安装确认IQ、设计确认DQ、运行确认OQ）在分析实验室运行后，其性能必须经过定期的性能确认PQ，或者按计量规程进行校准，确定其整机性能如仪器检出限等符合性能标准。如在JJG 705-2014液相色谱仪检定规程^[4]中，其最小检测浓度即仪器检出限的方法即信噪比法，通过进样低浓度的标准溶液，再根据标准溶液峰高和基线噪音峰高的比值计算，具体计算公式与公式2是一致的（其置信因子取2）：

由此可知，信噪比法反映出的是方法验证当时状态下系统检出限/定量限，而非对于方法的检测限/定量限，在实际使用不能盲从于信噪比3/10的结果。如作者以前在进行一个工艺相关杂质检测HPLC分析方法验证时，根据信噪比法计算的检测限位1μg/ml、定量限为3μg/ml（验证中S/N均大于10、均值在15左右），因此制定方法的标曲下限为5μg/ml，但在色谱柱使用几个批次之后，发现标曲下限5μg/ml的S/N就已经掉到10以下了，此时原检测限的S/N肯定也有着很大的变化，完全没有达到方法验证中检测限、定量限验证的目的。

4、检测限和定量限的解决方案

因为检测限和定量限常用测量方法的局限性，因此我们并不需要限定信噪比=3或10，而只需要验证方法的灵敏度符合要求。如通常检测限应低于限度的1/30，定量限应低于限度的1/10，但当达不到该要求时，只要规定定量限比ICH规定的杂质报告限低即可（如50%报告限）^[5]。

在检测限的验证中，可以通过加标的方法进行信噪比的确认，并可参考USP对于可检测性的定义和确认步骤^[6]：

-1：配置一个在限度浓度的杂质标准品溶液；

-2：配置一个添加了限度浓度的杂质标准品的样品标准品溶液；

-3：配置一个添加了（限度浓度100%-由Horwitz方程估算%RSD）的杂质标准品的样品标准品溶液；

如果1≤2且3＜2，则差异可以被检出；否则该方法不能胜任限度检测。

定量限可考虑设置一个低于限度数倍的低浓度样品（如5倍），在响应最差的仪器中信噪比仍然远大于10（如100），其回收率验证与精密度验证均符合规定，则可以认为该数字可以适用于今后的日常检测，如果检测结果小于该值，则直接报告“小于该值”即可^[3]。如在采用荧光染色法测定外源性DNA残留量中，ChP规定DNA残留量在1.25～80ng/ml范围内，本法线性较好，因此供试品DNA残留量在该范围内可定量测定；当DNA残留量低于1.25ng/ml时应为限量测定，表示为小于1.25ng/ml^[7]。

设计合理的定量下限对于方法的灵敏度有着很好的保证，在实际操作中只需要验证定量下限的准确度和精密度符合要求即可。如在复杂基质样品中，通常以标曲下限作为定量下限，且定量下限的准确度和精密度要求可适当放宽，要求校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15%以内，定量下限处应该在±20%内，质控样品准确度均值一般应在质控样品标示值的±15%之内，定量下限准确度应在标示值的±20%范围内^[8]。