有关物质含量的计算方法对于有关物质的计算，首先需要明确的是对各特定杂质的指认，杂质指认主要采用杂质对照品进行定位或相对保留时间两种方法，用杂质对照品进行指认最为准确。当杂质对照品不易获得或需检测的杂质较多时，可用相对保留时间的方法对杂质进行定位，如《中国药典》2015年版二部中有近450个品种的有关物质检查项下采用了相对保留时间的方法对杂质进行定位，但用相对保留时间定位也是存在一定风险的，尤其是对于梯度洗脱。虽然有如此多的品种用相对保留时间对杂质进行指认，但《中国药典》2015年版中并未对相对保留时间的计算做出规定，EP与USP对此做出了说明。相对保留时间分为校正的相对保留时间与未经校正的相对保留时间，校正的相对保留时间即目标峰与主成分峰的绝对保留时间均扣除死时间后的比值，而未经校正的相对保留时间即为目标峰与主成分峰绝对保留时间的比值，由于校正的相对保留时间每次都需测定死时间，EP与USP均规定如无特殊规定正文中的相对保留时间均指未经校正的相对保留时间。然而由于仪器和色谱系统之间的差异，即使采用相同的色谱柱，未经校正的相对保留时间往往也会有可能变动，尤其是对于梯度洗脱，为了提高相对保留时间的重现性，质量标准中可以采用校正的相对保留时间对杂质进行指认。

(1)外标法

采用杂质对照品法对已知杂质进行测定，这一方法专属性好，数据也最准确。但是除了原料合成中的中间体外，其他杂质对照品不易获得，价格昂贵。另外，有些不稳定的杂质，比如5-羟甲基糠醛，无法制备稳定的杂质对照品，也难以采用此方法。

(2)归一化法

归一化法通常指的是面积归一化法，该法的前提是假设所有杂质在既定的色谱条件下均能够被分离洗脱且有响应，高低浓度均在线性范围内并响应因子一致。该方法不需要对照品，如果满足假设条件，这一方法最为简单、准确、重现。但是当各杂质与主成分的响应值差异较大时，可能超出线性范围，因此对微量杂质的检查应格外注意。

(3)自身对照法

自身对照法就是通过杂质峰的面积与规定浓度主成分稀释溶液(一般是0.1％或0.5%)的峰面积比较，测定杂质的含量。

与归一化法一样，这一方法的优点同样是不需要杂质对照品，主要是克服了由于高低浓度的线性问题带来的误差，在国内药品标准中大多采用这一方法。

但是该方法同样也不能克服响应因子不同造成的误差，比如苯丙醇有关物质的检查(图14-10),HPLC归一化法和自身对照法的纯度都低于95%，苯丙醇中的主要杂质是苯丙酮，通过GC-MS和HPLC-MS分析证实样品中的杂质为苯丙酮，外标法测定结果表明苯丙醇中苯丙酮的含量只有0.18%。由于苯丙酮和苯丙醇的响应因子之间的巨大差异导致了外标法与自身对照和归一化法结果之间的差异。

图14-10 苯丙醇有关物质检查

1．苯丙醇；2．苯丙酮

在不考虑线性和响应因子的情况下，与归一化法相比，由于样品中杂质的存在，使自身对照溶液的浓度在计算中会引人误差，而且随杂质量的增加，计算结果与真实值之间的偏离就越大，从而过高地判断产品中的杂质。以单一杂质为例，假定药物A中只含有一种杂质B，在测定条件下A的进样浓度在线性范围内，且杂质B和主成分A的响应因子相同，计算如表14-4所示，从模拟数据的比较可以看出，自身对照法测定结果的相对偏差随着杂质实际含量的增加而线性增加(图14-11)。好在化学药品的纯度一般都比较高，上述误差在实际工作中并不明显。

表14-4 自身对照法与归一化法杂质含量测定结果间的差异

图14-11 自身对照法测定结果与实际含量的相对偏差

(4)加校正因子的自身对照法或面积归一化法

将各已知杂质的峰面积用校正因子校正后，再采用主成分自身对照法或面积归一化法计算，可有效排除杂质响应因子不同对结果的影响，该方法正被在国内外药典越来越普遍地采用。

(5)主成分对照品外标法

主成分对照品外标法包括加不校正因子的主成分对照品外标法和加校正因子的主成分对照品外标法。操作、计算分别与不加校正因子和加校正因子的主成分自身对照法基本一样，唯一不同的是前者要用主成分对照品制备一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照品溶液, 后者是由供试品溶液直接稀释得到一个浓度与杂质限度相当的溶液作为对照溶液。

由于主成分对照品是经过标定的，具有确定的纯度，因此其计算结果较主成分自身对照法更为准确。《中国药典》2015年版中尚未收录该法，但USP与EP中的品种大多采用加校正因子或不加校正因子的主成分对照品外标法计算杂质的含量。